ChIP實(shí)驗(yàn)常見問題

日期：2014-12-24 標(biāo)簽：ChIP實(shí)驗(yàn)常見問題

1：非特異性抗體對(duì)照背景高

可能原因：

（1）非特異性結(jié)合 Protein A 或G beads

（2）ChIP 緩沖液污染了

（3）有些Protein A or G beads 產(chǎn)生高背景

解決辦法：

（1）將標(biāo)本和beads混合孵育1hr后去除，然后再加入抗體進(jìn)行反應(yīng)（包括預(yù)純化標(biāo)本步驟）

（2）重新配制新的緩沖液

（3）有些Protein A/G beads 產(chǎn)生高背景.盡量使用在非特異性對(duì)照中背景很低的Protein A/G beads

2：背景高、電泳結(jié)果難以分辨大小

可能原因：DNA片段太大

解決辦法：對(duì)不同類型的細(xì)胞，DNA 片段化過程要進(jìn)行優(yōu)化。破碎后的DNA片段不應(yīng)該大于1.5 kbp. 如果使用酶消化染色質(zhì)的話，應(yīng)該可以看到單個(gè)核小體的存在 (175 bp)

3：信號(hào)弱

可能原因及解決辦法：

（1）染色質(zhì)的片段太小了。 染色質(zhì)超生破碎的大小不能小于500bp。太小的片段會(huì)使的核小體被誤認(rèn)為核小體間的DNA而被消化掉。如果做N-ChIP，酶切反應(yīng)足夠來片段化染色質(zhì)了。

（2）如做的是X-ChIP,有可能是細(xì)胞被交聯(lián)太久。 用甲醛交聯(lián)10-15分鐘然后用PBS洗滌。細(xì)胞可能需要用甘氨酸處理以去除多余的甲醛.過度的交聯(lián)會(huì)封閉抗原結(jié)合表位從而降低抗體的結(jié)合。

（3）染色質(zhì)用量不足。推薦每次實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)的用量是25 μg

（4）免疫沉淀用抗體量不足。推薦使用3-5 μg抗體進(jìn)行初次實(shí)驗(yàn)，如果沒有信號(hào)則可以增加到10μg的用量。

（5）特異性的抗體結(jié)合被清除了。洗液中的NaCl 濃度不能高于500 mM ，因?yàn)檫@個(gè)濃度過強(qiáng)，有可能會(huì)消除特異性的抗體結(jié)合。

（6）細(xì)胞沒有被完全裂解。推薦使用RIPA buffer裂解細(xì)胞（參考X-ChIP方法）。

（7）目標(biāo)區(qū)域沒有抗體被富集。 抗體結(jié)合表位不存在感興趣的DNA區(qū)域。使用陽性對(duì)照抗體，以保證整個(gè)操作過程的正確性，如H3K4me3/H3K9me3抗體對(duì)應(yīng)active/inactive promoters。

（8）不適合使用N-ChIP方法。當(dāng)待測(cè)蛋白和DNA的結(jié)合比較弱或者離DNA比較遠(yuǎn)時(shí)，最好使用X-ChIP。因?yàn)榻宦?lián)可以避免在操作過程中蛋白質(zhì)從DNA上脫落下來。而Histones通常具有很強(qiáng)的DNA親和力，因此分析時(shí)常用N-ChIP。

（9）所選的單克隆抗體可能不適合X-ChIP方法。 在交聯(lián)過程中，可能抗體的結(jié)合表位被封閉了。推薦使用多克隆抗體，因?yàn)榫哂卸鄠€(gè)抗原結(jié)合表位從而增加了IP靶蛋白的成功率。

（10）使用了錯(cuò)誤的抗體親和beads。 Protein A和G結(jié)合不同的Ig. 選擇使用能有效結(jié)合抗體的Protein beads。推薦使用protein A和G的葡聚糖混合物從而增加沉淀抗體的成功率。

4：PCR擴(kuò)增出現(xiàn)問題

可能原因及解決方法

（1）所有標(biāo)本包括模板對(duì)照 PCR結(jié)果信號(hào)均過高。real-time PCR溶液污染了，換用新鮮配制的新溶液重新進(jìn)行PCR。

（2）標(biāo)本PCR結(jié)果陰性。使用 standard/input DNA確認(rèn)引物是否正確。