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產(chǎn)品名稱：RAP 試劑盒
品牌名稱：廣州賽誠生物科技有限公司
所屬分類：RAP試劑盒
貨號：KT106
規(guī)格：12 rxns；24 rxns；48 rxns
目錄價格：0 元
- 產(chǎn)品描述
- 品牌介紹
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RAP實驗步驟
注：實驗全程環(huán)境為 Nuclease-free 環(huán)境，全過程須使用無 RNase 污染的實驗用具和試劑，操作過程中也要防止 RNase 污染
A 細(xì)胞裂解與染色體超聲斷裂
1.向Cell lysis buffer（SCAP-1）中加入蛋白酶抑制劑和RNA 酶抑制劑，每mL加入12uL PMSF（SCAP-9）和10uL蛋白酶抑制劑（SCAP-8）和5uL RNase inhibitor（SCAP-10）；
2.在交聯(lián)的細(xì)胞沉淀中加入 1mL 含有蛋白酶抑制劑和RNA 酶抑制劑的 Lysis Buffer，吹打重懸并渦旋震蕩 15s，然后在4℃旋轉(zhuǎn)裂解1-2h；
B 探針-RNA免疫沉淀
1.取上述步驟所得上清液45μL至1.5mL離心管，儲存于-20℃，此為Input。
2.取上述步驟所得上清液450μL至1.5mL或2mL的離心管中，加入2倍體積（即0.9mL）的Hybridization buffer（SCAP-2），并加入5uL RNase inhibitor（SCAP-10）,并按每個反應(yīng)加入100pmol（約500~600ng）探針的量加入標(biāo)記的DNA探針，于37℃旋轉(zhuǎn)孵4h。
3. 在探針與裂解液孵育將近4h時進(jìn)行磁珠預(yù)處理，即每個IP組取50uL鏈霉親和素磁珠（SCAP-7）只離心管中，于磁力架上靜置直到磁珠完全吸附到管壁上，吸除上清，再用500uL Lysis Buffer（SCAP-1）洗磁珠2次，吸除上清備用。
4.探針與裂解液孵育4h后，轉(zhuǎn)移至處理好的磁珠管中，37℃旋轉(zhuǎn)孵30min。
5.輕微離心后置于磁力架上待溶液澄清，棄掉上清液。
6.加入1mL Wash Buffer（SCAP-3）在37℃旋轉(zhuǎn)洗5min，輕微離心后置于磁力架上待溶液澄清棄掉上清液。
7.重復(fù)清洗5次。
8.清洗好的磁珠每個IP組取1/10-1/5磁珠于新EP管中用于提取RNA，剩下的用于提取蛋白。Input組取等量（1/10-1/5）提取RNA。
C RNA、蛋白的洗脫
RNA洗脫（1/10-1/5）：
1.向磁珠中加入50uL PK buffer(SCAP-4)和5uL Proteinase K(SCAP-6)，于65℃孵育45min，然后95℃孵育5min使DNA探針與目的RNA分開，迅速置于冰上，加入500uL的Trizol溶液渦旋振蕩10s，室溫靜置10min；input組直接加入500uL Trizol溶液提取RNA。
2.再加入100 μL 氯仿，渦旋振蕩10s，在4℃，12000rpm離心15min后小心吸取上層水相至新的離心管中；
3.加入2.5倍體積無水乙醇混勻（可選擇加入1-2uL糖原幫助沉淀，糖原可使用碧云天的）后置于-80℃沉淀過夜。
4.第二天取出在4℃，12000rpm離心15min后小心去除上清，然后用75%乙醇清洗沉淀3次，最后一次盡量完全去除上清，開蓋晾干3min左右，用15uLRNase-free H2O溶解。
蛋白的洗脫（剩余的磁珠和input）：
1.向磁珠中加入40uL elution buffer，100ug/mL RNase A和0.1U/uL RNase H，于37℃孵育30min;
注：這里的RNase A和RNase H是終濃度。
2.后加入10uL 5x蛋白Loading buffer，100℃煮10min后離心取上清于新的EP管中即為蛋白產(chǎn)物。蛋白產(chǎn)物可用于銀染，質(zhì)譜或WB檢測。
