Glucocorticoids mediate induction of microRNA-708 to suppress ovarian cancer metastasis through targeting Rap1B

日期：2017-09-13 標(biāo)簽：糖皮質(zhì)激素間接誘導(dǎo)microRNA-708以RaplB為靶標(biāo)抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移

mRNA翻譯調(diào)控研究案例（二）

一、調(diào)控通路

MicroRNA-708在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)量很低，當(dāng)細(xì)胞受到糖皮質(zhì)激素（GC）的刺激后，GC誘導(dǎo)GRα結(jié)合到miR-708的啟動子區(qū)促進(jìn)miR-708的表達(dá)，隨后miR-708與Rap-1B mRNA的3’-UTR區(qū)結(jié)合抑制mRNA翻譯表達(dá)，Rap-1B是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志蛋白，Rap-1B表達(dá)受到抑制后會抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

二、實驗流程

作者首先通過microRNA的表達(dá)微陣列和用q-pcr檢測microRNA708的表達(dá)篩選出在轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞中異常低表達(dá)的miR-708，后續(xù)研究就是圍繞miR-708進(jìn)行。對miR-708的研究作者分別進(jìn)行功能和機制的研究：（1）功能實驗：將miR-708和miR-708+anti轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲以及小鼠體內(nèi)實驗說明miR-708能抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。（2）機制實驗核心包括三個部分的內(nèi)容，一是miR-708的表達(dá)調(diào)控：作者用DEX處理細(xì)胞后檢測miR-708和Odz2 RNA的表達(dá)說明miR-708和Odz2共轉(zhuǎn)錄形成；然后通過ChIP實驗說明糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)GRα結(jié)合到MIR708基因啟動子上促進(jìn)miR-708的表達(dá)。二是通過熒光素酶實驗驗證MiR-708與Rap1B Mrna的3’-UTR互作抑制Rap1B的表達(dá)。

三、核心FIGURE

Figure1說明的是糖皮質(zhì)激素信號誘導(dǎo)GR與miR-708和ODZ4基因啟動子結(jié)合促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。

A、 用DEX處理細(xì)胞后檢測ODZ4和miR-708的表達(dá)，表明DEX處理使ODZ4和miR-708的表達(dá)都升高。

B、 對GRα敲低后檢測ODZ2和miR-708的表達(dá)，表明ODZ2和miR-708的表達(dá)受GRα的調(diào)控。

C、 分別用DEX和CHX處理細(xì)胞后檢測ODZ2和miR-708的表達(dá)，表明DEX使ODZ2和miR-708的表達(dá)上升。

D、 ODZ2和miR-708的基因組上的位置示意圖，ODZ2和miR-708共轉(zhuǎn)錄形成。

E-F、ChIP實驗，用DEX處理細(xì)胞后用H3和GR抗體獲取與蛋白結(jié)合的DNA片段然后進(jìn)行q-pcr檢測，表明DEX促進(jìn)GR與ODZ2啟動子結(jié)合。

Figure2說明的是miR-708以Rqp1B mRNA的3’-UTR為靶標(biāo)抑制蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

A、 維恩圖，預(yù)測的與Rqp1B相關(guān)的microRNA。

B-C、用miR-708、miR-708+anti轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，檢測Rqp1B mRNA和蛋白的表達(dá)，表明miR-708抑制Rqp1B的表達(dá)。

D、 熒光素酶實驗，將Rqp1B mRNA 3’-URT序列連接到熒光素酶報告質(zhì)粒上與miR-708共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測熒光素酶活性，表明miR-708通過與Rqp1B mRNA 3’-URT互作抑制蛋白的表達(dá)。

E、 分別對Rqp1B和Rqp1A敲低后檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，表明Rqp1敲低降低細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

F、 用DEX處理細(xì)胞后檢測Rqp1B、pGRα和GRα的表達(dá)，表明DEX使Rqp1B表達(dá)降低而使pGRα升高。

Figure3說明的是miR-708抑制細(xì)胞粘附因子的形成，而Rqp1B促進(jìn)細(xì)胞粘附因子的形成。

A、 蛋白-FISH，分別將MiR-708與Rqp1B敲低質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后與FN粘連然后檢測細(xì)胞中的Paxillin和b-actin，表明miR-708和Rqp1B敲低使黏附因子形成降低。

B、 分別將MiR-708與Rqp1B敲低質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測磷酸化的樁蛋白和焦粘附激酶，表明miR-708和Rqp1B敲低使磷酸化的樁蛋白和焦粘附激酶降低。

C、 檢測細(xì)胞的粘附性。

D、 蛋白-FISH，分別將miR-708與HA-Rqp1B重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測Paxillin和b-actin，表明miR-708使黏附因子形成降低，Rqp1B表達(dá)使粘附因子形成升高。

E-G、細(xì)胞粘附因子形成統(tǒng)計。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類似實驗的實驗設(shè)計及整體實驗外包項目，包括Q-PCR、Western Blot、ChIP、Luciferase檢測、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（敲低）、FISH，其中的Luciferase檢測、CHIP和FISH為本公司主營項目。

一、CHIP技術(shù)：主要研究蛋白與基因之間的關(guān)系。

用DEX處理細(xì)胞后用H3和GR蛋白抗體獲取細(xì)胞中與相應(yīng)蛋白結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行q-pcr檢測，表明DEX處理后細(xì)胞的GR與MIR708啟動子結(jié)合上升。我公司在實驗體系中設(shè)置陽性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

二、Luciferase檢測：驗證microRNA與靶標(biāo)3’-UTR的互作。

分別將Rap1B Mrna的3’-UTR序列和其突變序列連接到熒光素酶報告質(zhì)粒上，與miR-708和miR-708+anti708共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測細(xì)胞的熒光素酶活性，表明miR-708與Rap1B 3’-UTR互作抑制熒光素酶活性。

三、FISH：免疫熒光原位雜交技術(shù)，對蛋白、RNA、DNA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的定位、定量。

分別將MiR-708與Rqp1B敲低質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后與FN粘連然后檢測細(xì)胞中的Paxillin和b-actin，表明miR-708和Rqp1B敲低使黏附因子形成。

參考文獻(xiàn)：Kai-Ti Lin,Yu-Ming Yeh,Chi-Mu Chuang,et al. Glucocorticoids mediate induction of microRNA-708 to suppress ovarian cancer metastasis through targeting Rap1B[J].NATURE COMMUNICATIONS,2014,6:5917