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項(xiàng)目名稱：Enhancer 與 Super-enhancers
所屬分類：生物信息學(xué)分析
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技術(shù)服務(wù)描述
1. Enhancer 與 Super-enhancers
1.1. 增強(qiáng)子（Enhancer）
??所謂增強(qiáng)子（Enhancer），位于結(jié)構(gòu)基因附近，是一類非編碼DNA順式作用元件，在真核生物的發(fā)育過(guò)程中通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、輔因子以及染色質(zhì)復(fù)合物作用于啟動(dòng)子，可以激活或增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。簡(jiǎn)單說(shuō)：增強(qiáng)子是能夠增加啟動(dòng)子活性從而增加基因轉(zhuǎn)錄頻率的DNA序列。
圖1. 增強(qiáng)子及復(fù)合物結(jié)構(gòu)示例圖
??增強(qiáng)子通常具有以下特點(diǎn)： ① 在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)5'或3'側(cè)均能起作用； ② 相對(duì)于啟動(dòng)子的任一指向均能起作用； ③ 發(fā)揮作用與受控基因的遠(yuǎn)近距離相對(duì)無(wú)關(guān)； ④ 對(duì)異源性啟動(dòng)子也能發(fā)揮作用； ⑤通常具有一些短的重復(fù)順序。
??增強(qiáng)子分為以下兩種類型： ⑴ 細(xì)胞特異性增強(qiáng)子：能夠在特定的細(xì)胞或特定的細(xì)胞發(fā)育階段選擇性調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的增強(qiáng)子稱為細(xì)胞特異性增強(qiáng)子。例如，B細(xì)胞免疫球蛋白重鏈基因或輕鏈基因的增強(qiáng)子，只有在胚胎干細(xì)胞分化為B細(xì)胞時(shí)，才能對(duì)Ig基因起正調(diào)控作用。此外，α-類和β-類珠蛋白基因簇上游非編碼區(qū)中均存在紅細(xì)胞系特異性增強(qiáng)子。 ⑵ 誘導(dǎo)性增強(qiáng)子：在特定刺激因子的誘導(dǎo)下，才能發(fā)揮其增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)子稱為誘導(dǎo)性增強(qiáng)子。如激素反應(yīng)元件（HRE）及金屬應(yīng)答元件（MRE）
1.2. 超級(jí)增強(qiáng)子（Super-enhancers）
??除了增強(qiáng)子是調(diào)控細(xì)胞基因時(shí)空表達(dá)關(guān)鍵的順式作用元件外，2013年，Richard A. Young 實(shí)驗(yàn)室基于當(dāng)時(shí)增強(qiáng)子的研究，提出了超級(jí)增強(qiáng)子(Super-enhancers, SEs)概念[1]。超級(jí)增強(qiáng)子是具有轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)子的一個(gè)大簇， 富集高密度的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(Master transcription factors)、輔因子(Cofactor)和增強(qiáng)子表觀修飾標(biāo)記(Histone modification marks)(見圖1)。在功能上超級(jí)增強(qiáng)子能夠驅(qū)動(dòng)控制細(xì)胞身份基因的表達(dá)，可以用來(lái)解釋細(xì)胞類型特異的表達(dá)模式，在發(fā)育生物學(xué)、癌癥等疾病致病機(jī)理研究中顯示出巨大的應(yīng)用潛力[1-4]。胚胎干細(xì)胞中的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、Esrrb、Nr5a2、Prdm14、Tcfcp2l1、Smad3、Stat3、Tcf3）富集在超級(jí)增強(qiáng)子上，在之前的研究中發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄因子在胚胎干細(xì)胞中起著十分重要的作用。
??Richard A. Young曾激動(dòng)地預(yù)言道：“‘超級(jí)增強(qiáng)子’具有廣闊的研發(fā)前景和價(jià)值，必將成為下一個(gè)藥物研發(fā)的黃金靶點(diǎn)！” 因此開展腫瘤相關(guān)超級(jí)增強(qiáng)子的研究，將有助深入解開腫瘤發(fā)病機(jī)制，并且可用于指導(dǎo)抗腫瘤藥物的高效研發(fā)，具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
圖2. 超級(jí)增強(qiáng)子及復(fù)合物結(jié)構(gòu)示例圖
圖3. 增強(qiáng)子與超級(jí)增強(qiáng)子及復(fù)合物結(jié)構(gòu)對(duì)比示例圖
(a) Enhancers and SEs are occupied by a high density of transcriptional regulators, including transcription factors, coactivators, and the RNA pol II complex.
(b) A phase separation model of SE activation. High-density interactions between transcriptional regulators form phase-separated multimolecular complexes at the SE locus, leading to the transcription of SE-driven genes.
2. 超級(jí)增強(qiáng)子的鑒定
??目前對(duì)增強(qiáng)子鑒定，主要采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP-seq） 針對(duì)活性增強(qiáng)子相關(guān)聯(lián)的因子或組蛋白修飾進(jìn)行檢測(cè)，如轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔激活因子(如Mediator、p300)、組蛋白修飾H3K27ac 和H3K4me1等?；钚栽鰪?qiáng)子通常同時(shí)含有H3K27ac 和H3K4me1 修飾，而靜態(tài)增強(qiáng)子(poised enhancer)一般同時(shí)具有H3K4me1 和H3K27me3 組蛋白標(biāo)記[4-6]。在此基礎(chǔ)上，超級(jí)增強(qiáng)子依據(jù)增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄活性標(biāo)記分子結(jié)合水平強(qiáng)度的差異進(jìn)行鑒定。在分析方法上，首先對(duì)所得增強(qiáng)子進(jìn)行縫合。主要依據(jù)在基因組范圍內(nèi)，這些單個(gè)增強(qiáng)子實(shí)體間如在12.5 kb 范圍內(nèi)，則合并為單個(gè)實(shí)體，即縫合增強(qiáng)子(Stitched enhancer)。最后，確定超級(jí)增強(qiáng)子和普通增強(qiáng)子之間的閾值?？p合增強(qiáng)子和其余的單個(gè)增強(qiáng)子按照ChIP-seq所測(cè)信號(hào)水平的強(qiáng)度排序，繪制獲得一張曲線圖，該曲線上斜率為1 的切線的切點(diǎn)所得的信號(hào)值為區(qū)分超強(qiáng)增強(qiáng)子和普通增強(qiáng)子之間的閾值，高于該值為超級(jí)增強(qiáng)子，其余的則稱為普通增強(qiáng)子(Typical enhancer)[1,2]（見圖2，圖3）
圖2. 確定超級(jí)增強(qiáng)子和普通增強(qiáng)子之間的閾值[1]
圖3. 普通增強(qiáng)子與超級(jí)增強(qiáng)子示例圖[3]
總結(jié)下來(lái)，識(shí)別增強(qiáng)子有以下幾種方法：
(1) Chip-seq/Chip-chip識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，
(2) 增強(qiáng)子特異的因子也可用于識(shí)別增強(qiáng)子，如EP300，EP300 的結(jié)合位點(diǎn)常用于預(yù)測(cè)增強(qiáng)子；
(3) RNA 聚合酶 Ⅱ 能與數(shù)千個(gè)增強(qiáng)子結(jié)合，所以 RNA 聚合酶 Ⅱ 的最大亞基POLR2A 也可用于尋找增強(qiáng)子位點(diǎn)；
(4) 脫氧核糖核酸酶 Ⅰ 超敏位點(diǎn) (DHS) 代表開放染色質(zhì)區(qū)域，許多覆蓋有增強(qiáng)子；
(5) 甲醛輔助分離調(diào)控元件 (FAIRE) 結(jié)合測(cè)序，能識(shí)別大量激活調(diào)控元件，包括增強(qiáng)子；
(6) 一些組蛋白修飾模式反應(yīng)了不同的染色質(zhì)狀態(tài)，如H3K4me1 和 H3K27ac 的結(jié)合廣泛用于增強(qiáng)子的標(biāo)記；
(7) 增強(qiáng)子序列能夠轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子RNA(eRNA) 也是激活增強(qiáng)子的標(biāo)志；
(8) 染色體 3D 構(gòu)象的方法 (e.g. 5C and ChIA-PET, Capture-C) 也能提供增強(qiáng)子 - 啟動(dòng)子相互作用的信息。
??鑒定出超級(jí)增強(qiáng)子之后，可以根據(jù)基因位置預(yù)測(cè)超級(jí)增強(qiáng)子所調(diào)控的編碼蛋白基因和非編碼RNA的表達(dá)，通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)超級(jí)增強(qiáng)子和腫瘤異常高表達(dá)的mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而推斷關(guān)鍵的超級(jí)增強(qiáng)子，進(jìn)一步鎖定腫瘤相關(guān)的基因，有利于指導(dǎo)下一步的抗腫瘤功能研究。
3. 其他資料
定義超級(jí)增強(qiáng)子。
（a） 說(shuō)明了定義超級(jí)增強(qiáng)子的三個(gè)步驟。
步驟1：通過(guò)調(diào)用細(xì)胞類型特異性主轉(zhuǎn)錄因子的芯片序列數(shù)據(jù)來(lái)定義增強(qiáng)子基因座。
步驟2：將12.5kb范圍內(nèi)的增強(qiáng)子組合成縫合的增強(qiáng)子區(qū)域。下一步將使用縫合的增強(qiáng)子區(qū)域和12.5 kb范圍內(nèi)沒(méi)有伙伴的增強(qiáng)子來(lái)識(shí)別超級(jí)增強(qiáng)子。
步驟3：計(jì)算每個(gè)增強(qiáng)子區(qū)域（縫合和單個(gè)增強(qiáng)子）的Med1的ChIP seq信號(hào)。所有增強(qiáng)子區(qū)域都是根據(jù)y軸上的Med1富集度沿x軸排列的。超級(jí)增強(qiáng)子定義為結(jié)果曲線拐點(diǎn)右側(cè)的區(qū)域（以灰色突出顯示）。
（b） 表中總結(jié)了步驟1和3中用于定義不同論文中的超級(jí)增強(qiáng)子的所有因子組合，表明在沒(méi)有Med1芯片序列數(shù)據(jù)的情況下可以定義超級(jí)增強(qiáng)子。
一些案例
文獻(xiàn)：Assessing eRNAs associated with a cytokine-sensing mammary super-enhancer | bioRxiv：
Wap超增強(qiáng)子組成元素中STAT5結(jié)合位點(diǎn)的刪除導(dǎo)致STAT5結(jié)合，H3K27Ac和增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄的減少。
（A）攜帶單個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子缺失小鼠的L1乳腺組織中的ChIP-seq顯示了增強(qiáng)子之間的協(xié)同作用，以有效募集STAT5。在位點(diǎn)消除了H3K27Ac所有三種增強(qiáng)子的喪失。
（B）通過(guò)Taqman測(cè)定法測(cè)量野生型和突變小鼠中的eRNA的表達(dá)