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技術(shù)服務描述
建庫測序流程
??MicroRNA (miRNA) 是一類長度約為20-24個核苷酸長度的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，miRNA 是生物體內(nèi)一類重要的特殊分子，誘導基因沉默，參與細胞生長、發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等諸多生命活動的調(diào)控過程。
??從RNA樣品到最終分析結(jié)果數(shù)據(jù)，需要經(jīng)過樣品檢測、建庫、測序和信息分析等過程，其中測序過程我們采用高通量測序illumina HiSeq/MiSeq測序平臺；illumina測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（Sequenced Reads），我們稱之為Raw Data或Raw Reads，結(jié)果以FASTQ（簡稱為fq）文件格式存儲，其中包含測序序列（reads）的序列信息以及其對應的測序質(zhì)量信息。
??樣品質(zhì)量檢測：利用NanoDrop 2000分光光度計對RNA樣品進行初步定量，Aglient 2100對樣品濃度精確定量。RNA樣品總量、濃度、完整性（RIN值，RNA Integrity Number）、純度（OD260/OD280比值）符合收樣立項標準后，進入下一步的文庫構(gòu)建。
??文庫構(gòu)建：Total RNA PEG (polyethylene glycol)沉淀，連接3’接頭，PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 膠分離回收，連接5’接頭，反轉(zhuǎn)錄，PCR擴增，文庫切膠回收。
??文庫質(zhì)檢：Q-PCR方法對文庫進行精確定量，文庫有效濃度>2nM即可上機測序。
??上機測序：將各文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后，進行SE75測序。
圖1: Small RNA 文庫構(gòu)建 Workflow
??Small RNA測序的接頭信息：
??RNA 5‘Adapter (RA5), part:
??5’-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC-3’
??RNA 3’Adapter (RA3), part:
??5’-AGATCGGAAGAGCACACGTCT-3’ (1ug流程)
??5’-CTGTAGGCACCATCAATCAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-3’ (10ug流程)
信息分析流程
??Raw Data通過去接頭、去低質(zhì)量、去污染、統(tǒng)計序列長度分布等過程完成初級分析；將初級分析得到的clean reads與ncRNA庫比對，分類注釋ncRNA，并去除reads中的rNRA、tRNA、snRNA、snoRNA等；然后再將reads比對到參考基因組、miRBase上，計算miRNA表達量，注釋已知miRNA、預測新的miRNA；然后進行差異miRNA、靶基因預測、功能注釋等后續(xù)分析。
miRNA生物信息分析流程圖
