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項(xiàng)目名稱：Luciferase（3’UTR活性驗(yàn)證）
所屬分類：Lucifefase實(shí)驗(yàn)
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技術(shù)服務(wù)描述
螢光素酶是理想的報(bào)告基因，因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶。單報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)往往會(huì)受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響，而雙報(bào)告基因則通過(guò)共轉(zhuǎn)染的“對(duì)照”作為內(nèi)參為實(shí)驗(yàn)提供一基準(zhǔn)線，從而可以在最大程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。Dual-Luciferase雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒(méi)有種源同源性并對(duì)應(yīng)不同的反應(yīng)底物，故而沒(méi)有交叉干擾。得益于超強(qiáng)的光信號(hào)和超高的信噪比，本系統(tǒng)被廣泛用于miRNA靶基因驗(yàn)證。
由于miRNA主要通過(guò)作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至載體中報(bào)告基因luciferase的后面， 通過(guò)比較過(guò)表達(dá)或者干擾miRNA后，報(bào)告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測(cè)螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對(duì)目的基因的抑制作用；結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。
miRNA靶基因Luciferase實(shí)驗(yàn)常用載體——psiCHECK2
PCR擴(kuò)增Luciferase點(diǎn)突變靶基因
服務(wù)流程
1. PCR擴(kuò)增靶基因的3’-UTR（WT），或直接合成結(jié)合位點(diǎn)序列；
2. 點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)靶基因的3’-UTR（MUT）并以PCR擴(kuò)增，或直接合成序列；
3. 將上述兩種DNA片段分別克隆至報(bào)告載體psiCHECK2質(zhì)粒；
4. 將報(bào)告載體與模擬物（mimic）或抑制物（inhibitor）共轉(zhuǎn)染待檢細(xì)胞；
5. 多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平。
客戶提供
1. 目的基因、目的miRNA的相關(guān)信息；
2. 目的miRNA的模擬物（mimic）或抑制物（inhibitor）；
3. 作克隆模板用途的細(xì)胞或組織樣品；
4. 需轉(zhuǎn)染并作最后檢測(cè)用途的細(xì)胞樣品。
賽誠(chéng)提供
1. 原始數(shù)據(jù)、結(jié)果圖片；
2. 標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告；
3. SCI標(biāo)準(zhǔn)Result Figure。