A Feedforward Regulatory Loop between HuR and the Long Noncoding RNA linc-MD1 Controls Early Phases of Myogenesis

日期：2017-07-28 標(biāo)簽：ceRNA機制

ceRNA機制研究案例（四）

一、調(diào)控通路：

LncRNA MD1上有一段miR-133的前體序列。在細胞分化前，HuR蛋白結(jié)合到Lnc-MD1上抑制Lnc-MD1的剪切斷裂，Lnc-MD1作為miR-133的海綿吸附體使miR-133前體序列結(jié)合miR-133，解除miR-133對HuR Mrna翻譯的抑制促進HuR的表達。在細胞分化時，Lnc-MD1斷裂釋放miR-133前體使miR-133表達升高，miR-133結(jié)合到HuR mRNA的3’-UTR上抑制HuR的表達從而使得Lnc-MD1又可作為miR-133的前體。

二、 實驗流程：

作者首先進行熒光素酶實驗檢測HuR與Lnc-MD1的關(guān)系以及對Lnc-MD1過表達和敲低后檢測HuR的表達，表明LncMD1對HuR的促進作用。隨后分別用RIP和RNA pull-down來驗證Lnc-MD1與HuR、Ago2的結(jié)合，用RNA-RNA pull-down驗證Lnc-MD1與miR-133結(jié)合。然后通過EMSA實驗驗證HuR與Lnc-MD1并驗證了與Lnc-MD1的結(jié)合位點說HuR結(jié)合到Lnc-MD1上的miR-133前體序列上。最后作者通過檢測細胞分化過程中的Lnc-MD1、miR-133和HuR的表達，以及檢測HuR敲低后的Lnc-MD1的表達，表明HuR抑制Lnc-MD1轉(zhuǎn)變?yōu)閙iR-133。

三、核心FIGURE：

Figure1說明的是Lnc-MD1對HuR蛋白表達的影響。

A-C、熒光素酶實驗，將HuR mRNA3’-UTR連接到熒光素酶報告質(zhì)粒上與Lnc-MD1表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后檢測細胞的熒光素酶活性。

E、 Q-PCR檢測Lnc-MD1過表達/敲低，WB檢測Lnc-MD1過表達/敲低后HuR蛋白的表達。表明Lnc-MD1促進HuR的表達。

Figure2說明的是HuR與Lnc-MD1結(jié)合后，Lnc-MD1作為miR-133的吸附體結(jié)合miR-133。

A、 RIP實驗，用HuR蛋白抗體從小鼠和人的細胞中釣取與HuR結(jié)合的RNA，然后進行Q-PCR檢測，表明HuR與Lnc-MD1結(jié)合。

B、 Ago2-RIP，用Ago2抗體釣取與Ago2蛋白結(jié)合的RNA，然后然后進行Q-PCR檢測，表明Ago2與Lnc-MD1結(jié)合。

C、 RNA pull-down/RNA-RNA pull-down，用Lnc-MD1探針釣取與之結(jié)合蛋白和RNA，產(chǎn)物進行WB和Q-PCR檢測，表明Lnc-MD1能與HuR、Ago2蛋白結(jié)合，也與miR-133高度結(jié)合。

D、 EMSA實驗，用Lnc-MD1探針與HuR進行體外結(jié)合實驗，表明lnc-MD1包含miR-133序列區(qū)段與HuR結(jié)合。

E、 EMSA實驗，用MD1-133b探針與冷探針進行體外結(jié)合HuR實驗，表明兩者具有競爭關(guān)系。

F、 EMSA實驗，用MD1-133b探針、突變探針和HuR進行體外結(jié)合實驗，突變后的MD1-133不與HuR結(jié)合。

Figure3說明的是HuR對Lnc-MD1和miR-133的影響。

A、 細胞分化過程中WB檢測HuR，RT-PCR檢測Lnc-MD1，NB檢測miR-133的表達。表明在細胞分化中期（48-72h）HuR和Lnc-MD1表達升高，在分化后期HuR和Lnc-MD1表達下降，而pre-miR-133b和miR-133b的表達升高。

B、 Lnc-MD1作為miR-133前體的示意圖。

C、 Q-pcr檢測HuR敲低后Lnc-MD1、pre-miR-133b和miR-133b的表達，表明HuR敲低后，Lnc-MD1下降，pre-miR-133b和miR-133b升高。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進行以上類似實驗的實驗設(shè)計及整體實驗外包項目，包括q-pcr、WB、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達/敲低）、luciferase Assay、RIP、Ago2-RIP、RNA pull-down、RNA-RNA pull-down、EMSA、Nortern blot，其中l(wèi)uciferase Assay、RIP、Ago2-RIP、RNA pull-down、RNA-RNA pull-down、EMSA為本公司主營項目。

一、   luciferase Assay：檢測microRNA與靶標(biāo)基因3’-UTR的關(guān)系。

將HuR mRNA上包含miR-133結(jié)合位點或miR-133結(jié)合位點缺失的3’-UTR連接到熒光素酶報告質(zhì)粒上，然后與Lnc-MD1或Lnc-MD1上133結(jié)合位點缺失的表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后檢測細胞的熒光素酶活性。

二、RIP/ago2-RIP實驗：RIP(RNA 免疫共沉淀)技術(shù)主要研究蛋白與RNA的相互作用。

利用HuR抗體從小鼠細胞和人細胞裂解液中釣取與HuR蛋白結(jié)合的RNA，產(chǎn)物進行qrt-PCR檢測，結(jié)果表明Lnc-MD1與HuR蛋白結(jié)合。我公司在實驗體系中設(shè)置陽性及陰性對照，進一步排除系統(tǒng)誤差。

Ago2-RIP，Ago2是一種與microRNA結(jié)合后調(diào)控Mrna翻譯的蛋白，本實驗利用Ago2-抗體釣取與ago2蛋白結(jié)合的RNA，產(chǎn)物進行Q-PCR檢測，表明Lnc-MD1與Ago2結(jié)合。我公司在實驗體系中設(shè)置陽性及陰性對照，進一步排除系統(tǒng)誤差。

三、RNA pull-down：檢測RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實驗手段之一。

用Lnc-MD1探針釣取與RNA結(jié)合的蛋白，然后進行WB驗證，表明Lnc-MD1結(jié)合Ago2和HuR。

四、 RNA-RNA pull-down：檢測RNA與其靶RNA之間相互作用的主要實驗手段。

用Lnc-MD1探針釣取與之結(jié)合的RNA，產(chǎn)物進行Q-PCR檢測，結(jié)果表明miR-133與Lnc-MD1高度結(jié)合。

參考文獻：Ivano Legnini, Mariangela Morlando, Arianna Mangiavacchi，et al. A Feedforward Regulatory Loop between HuR and the Long Noncoding RNA linc-MD1 Controls Early Phases of Myogenesis. Molecular Cell,2013, 53, 506–514