Epigenetic silencing of microRNA-137 enhances ASCT2 expression and tumor glutamine metabolism

日期：2017-08-23 標(biāo)簽：Epigenetic,silencing,of,microRNA-137,enhances,ASCT2,expression,and,tumor,glutamine,metabolism

DNA甲基化研究案例（二）

一、調(diào)控通路

當(dāng)DNMT（甲基轉(zhuǎn)移酶）抑制劑消耗完時，DNMT結(jié)合到靶標(biāo)基因miR-137的啟動子上對啟動子DNA進行甲基化修飾從而抑制miR-137表達；當(dāng)DNMT抑制劑存在時，DNMT不能結(jié)合到靶標(biāo)基因miR-137的啟動子上從而使miR-137順利表達，而miR-137會結(jié)合到ASCT2 Mrna的3’-UTR抑制其翻譯為蛋白質(zhì)；ASCT2是谷氨酰胺代謝過程的關(guān)鍵酶，ASCT2的表達促進谷氨酰胺的代謝。

二、實驗流程

本文中作者分為兩個部分進行闡述：miR-137作用于ASCT2 mRNA的3’-UTR抑制ASCT的表達，從而使谷氨酸代謝減弱；甲基化酶結(jié)合到miR-137啟動子上促進DNA甲基化抑制miR-137的表達。（1）作者首先通過三種方法預(yù)測以ASCT2為靶標(biāo)的microRNA，建立miR-137和miR-122過表達細(xì)胞株檢測ASCT的表達表明miR-137和miR-122過表達使ASCT2表達降低，然后用WB檢測其他microRNA過表達后的ASCT2的表達表明處理miR-137和miR-122外其他microRNA均不影響ASCT表達，于是作者又通過對不同細(xì)胞系進行miR-137過表達后檢測ASCT2的表達進一步驗證miR-137對ASCT2表達的抑制；為了驗證miR-137對ASCT2的抑制機制，作者通過3’-UTR熒光素酶實驗驗證miR-137與ASCT2 3’-UTR結(jié)合從而抑制蛋白表達；作者通過對ASCT2敲低、miR-137敲低和抑制后細(xì)胞谷氨酰胺代謝的檢測驗證miR-7通過抑制ASCT表達來抑制谷氨酰胺的代謝。（2）作者用CHIP實驗技術(shù)驗證了甲基轉(zhuǎn)移酶MECP2、DNMT1和DNMT3B與miR-137啟動子上的CpG島結(jié)合使其甲基化抑制miR-137的表達，然后檢測MeCP2敲低或5-Aza-CdR處理后的細(xì)胞的miR-137的表達和谷氨酰胺的代謝。

三、核心FIGURE

Figure1說明的是miR-137作用于ASCT2 Mrna的3’-UTR抑制ASCT2的表達，降低谷氨酸代謝。

A、 不同方法預(yù)測以ASCT2作為靶標(biāo)的microRNA。

B、 對miR-137、miR-122過表達后細(xì)胞檢測ASCT2的表達，表明miR-137和miR-122過表達使ASCT2的表達降低。

C、 對一系列的microRNA過表達，然后用WB檢測ASCT2的表達，表明只有MiR-137和miR-122過表達后使ASCT2表達下降。

D、 MiR-137與ASCT2 Mrna 3’-UTR結(jié)合位點預(yù)測。

E-F、分別用Q-PCR和WB檢測不同細(xì)胞系miR-137過表達后ASCT2的表達，表明miR-137過表達使細(xì)胞的ASCT2表達降低

G、熒光素酶實驗，檢測miR-137與ASCT2 3’-URT的關(guān)系。

H、ASCT2敲低或miR-137過表達后檢測谷氨酰胺的消耗。

I、對miR-137抑制后檢測谷氨酰胺的代謝活性，表明miR-137抑制后，谷氨酰胺代謝增強。

Figure2說明的是甲基化酶MeCP2、DNMT1、DNMT3B結(jié)合到miR-137啟動子CpG島使DNA甲基化，抑制miR-137的表達，從而降低谷氨酸代謝。

A、 CHIP實驗，分別用MeCP2、DNMT1和DNMT3B抗體釣取細(xì)胞中與蛋白結(jié)合的DNA片段，然后進行q-pcr驗證，表明這幾種蛋白結(jié)合到miR-137啟動子的CpG島。

B、 對MeCP2敲低后檢測miR-137表達，表明MeCP2抑制miR-137的表達。

C、 對MeCP2敲低后檢測ASCT2的表達，表明MeCP2促進ASCT2的表達。

D-E、用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR處理細(xì)胞后檢測miR-137和ASCT2的表達，表明5-Aza-CdR使miR-137表達升高而使ASCT2表達降低。

F-G、MeCP2敲低或用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR處理細(xì)胞后檢測谷氨酰胺代謝，表明MeCP2降低后谷氨酰胺代謝降低。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進行以上類似實驗的實驗設(shè)計及整體實驗外包項目，包括Q-PCR、Western Blot、Luciferase檢測、CHIP、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達/敲低），其中的Luciferase檢測、CHIP為本公司主營項目。

一、 Luciferase檢測：驗證microRNA與靶標(biāo)3’-UTR的互作。

將ASCT2 3’-UTR序列構(gòu)建至載體中報告基因luciferase的后面，通過過表達miR-137檢測熒光素酶活性，說明了miR-137作用于ASCT2 3’-UTR抑制基因表達。

二、CHIP技術(shù)：主要研究蛋白與基因啟動子之間的關(guān)系。

利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。后解交聯(lián)，聯(lián)用Q-PCR檢測。本實驗分別用MeCP2、DNMT1和DNMT3B抗體釣取細(xì)胞中與蛋白結(jié)合的DNA片段，然后進行q-pcr檢測，表明MeCP2、DNMT1和DNMT3B與miR-137啟動子的CpG島結(jié)合。

參考文獻：J Dong,D Xiao,Z Zhao,et al.Epigenetic silencing of microRNA-137 enhances ASCT2 expression and tumor glutamine metabolism. Oncogenesis,2017,6,e356