Dicer promotes tumorigenesis by translocating to nucleus to promote SFRP1 promoter methylation in cholangiocarcinoma cells

日期：2017-08-23 標(biāo)簽：甲基化

DNA甲基化研究案例（三）

一、調(diào)控通路

膽管癌細(xì)胞的Dicer高度表達(dá)后進(jìn)入細(xì)胞核，與HP1α蛋白復(fù)合體結(jié)合互作，促進(jìn)SFRP1啟動(dòng)子的組蛋白和CpG島DNA甲基化，從而抑制SFRP1的表達(dá)。

二、實(shí)驗(yàn)流程

作者首先通過免疫組化檢測(cè)膽管癌細(xì)胞和癌旁組織細(xì)胞的Dicer的表達(dá)情況表明膽管癌細(xì)胞的Dicer高表達(dá)，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離后分別檢測(cè)Dicer含量表明高表達(dá)的Dicer大部分進(jìn)入細(xì)胞核。為了研究Dicer的作用機(jī)制，分別進(jìn)行GST pull-down和co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Dicer進(jìn)入細(xì)胞核中與HP1α蛋白復(fù)合體結(jié)合互作，隨后作者對(duì)Dicer敲低后的細(xì)胞系檢測(cè)組蛋白的甲基化情況表明Dicer使染色體組蛋白甲基化。為了說明Dicer促進(jìn)SFRP1啟動(dòng)子甲基化，作者進(jìn)行CHIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Dicer、HP1α、H3k9me3結(jié)合，并通過重亞硫酸鹽PCR檢測(cè)SFRP1啟動(dòng)子的CpG島甲基化情況表明Dicer促進(jìn)DNA甲基化。最后作者進(jìn)行Dicer的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)腫瘤進(jìn)程的作用。

三、核心FIGURE

Figure1說明的是腫瘤細(xì)胞Dicer特異表達(dá)然后進(jìn)入細(xì)胞核與核內(nèi)的HP1α蛋白復(fù)合物互作。

A、 免疫組化檢測(cè)正常組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的Dicer，表明腫瘤細(xì)胞的Dicer表達(dá)量升高并且轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。

B、 核質(zhì)分離檢測(cè)正常組織細(xì)胞系HIBEpic和腫瘤細(xì)胞系Hucct1、TFK1中的Dicer，表明腫瘤細(xì)胞的Dicer表達(dá)量升高并且細(xì)胞核含量比細(xì)胞質(zhì)含量高。

C、 GST-pulldown，分別表達(dá)純化GST-HP1α和GST-Dicer融合蛋白與細(xì)胞蛋白提取液孵育后用GST抗體釣取與標(biāo)簽蛋白結(jié)合的蛋白，然后進(jìn)行WB驗(yàn)證，表明HP1α和Dicer有互作。

D、 Co-IP，分別用HP1α和Dicer從HIBEpic和Hucct1細(xì)胞中釣取與蛋白結(jié)合的蛋白進(jìn)行WB驗(yàn)證，表明HP1α和Dicer有互作。

E、 Co-IP，用HP1α抗體釣取細(xì)胞中與HP1α結(jié)合的蛋白，然后進(jìn)行WB驗(yàn)證，表明DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、SUV39H1、H3K9me3與HP1α有互作。

Figure2說明的是Dicer調(diào)節(jié)膽管癌細(xì)胞的染色體修飾。

A、q-pcr檢測(cè)Dicer敲低慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系中Dicer Mrna的表達(dá)。

B-C、WB分別檢測(cè)Dicer敲低慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的Dicer含量，表明腫瘤細(xì)胞系的Dicer表達(dá)量總是高于正常組織細(xì)胞系表達(dá)量，并且細(xì)胞核含量高于細(xì)胞質(zhì)。

D、WB檢測(cè)Dicer敲低慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的H3K9me3，表明腫瘤細(xì)胞Dicer敲低后組蛋白甲基化水平降低，而正常細(xì)胞系不受影響。

Figure3說明的是Dicer促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的SFRP1啟動(dòng)子CpG島甲基化抑制SFRP1的表達(dá)。

A、 通過Dicer敲低慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測(cè)幾種基因的甲基化水平。

B、 SFRP1啟動(dòng)子CpG島以及進(jìn)行CHIP和重亞硫酸鹽PCR的示意圖。

C、 CHIP實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Dicer、HP1α、H3K9me3與SFRP1啟動(dòng)子的結(jié)合。

D、 重亞硫酸鹽PCR檢測(cè)SFRP1啟動(dòng)子DNA甲基化水平，表明腫瘤細(xì)胞DNA甲基化水平很高，Dicer敲低后DNA甲基化水平顯著降低，而正常細(xì)胞系的甲基化水平很低，Dicer敲低后不影響DNA的甲基化。

E、 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理和Dicer敲低后檢測(cè)SFRP1的mRNA，表明啟動(dòng)子甲基化影響基因的轉(zhuǎn)錄。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目

本公司可進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及整體實(shí)驗(yàn)外包項(xiàng)目，包括WB、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達(dá)/敲低）、核質(zhì)分離、Q-PCR、GST pull-down、co-IP、CHIP，其中GST pull-down、co-IP、CHIP為本公司主營項(xiàng)目。

一、GST pull-down：驗(yàn)證蛋白與蛋白互作的重要手段。

利用GST融合蛋白沉降技術(shù)，將靶蛋白與GST標(biāo)簽蛋白在細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行融合表達(dá)，純化獲取融合表達(dá)蛋白，與細(xì)胞蛋白提取液孵育，然后用標(biāo)簽抗體釣取蛋白-蛋白復(fù)合物，復(fù)合物進(jìn)行WB驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)表明HP1α和Dicer有互作。

二、 CO-IP：確定兩種或多種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。

本實(shí)驗(yàn)用HP1α抗體釣取細(xì)胞內(nèi)與HP1α蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)，產(chǎn)物用相應(yīng)目的蛋白抗體進(jìn)行WB驗(yàn)證，表明了細(xì)胞內(nèi)HP1α與DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、SUV39H1、H3K9me3有互作。

三、 CHIP：主要研究蛋白與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系。

利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。后解交聯(lián)，聯(lián)用Q-PCR檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)分別用HP1α、Dicer、H3k9me3抗體釣取與之結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行q-pcr檢測(cè)表明這些蛋白與SFRP1啟動(dòng)子結(jié)合。

參考文獻(xiàn)：Wenlong Cheng,Yongqiang Qi,Li Tian,et al. Dicer promotes tumorigenesis by translocating to nucleus to promote SFRP1 promoter methylation in cholangiocarcinoma cells[J]. Cell Death and Disease,2017,8,e2628