LncRNA Directs Cooperative Epigenetic Regulation Downstream of Chemokine Signals

日期：2017-07-14 標簽：Lnc,RNA,BCAR4,GLI2,Phosphorylation,H3K18,acetylation,Locked,Nucleic,Acid

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（一）調(diào)控通路：

胞外因子CCL21通過激活RhoC/CIT通路促進GLI2的磷酸化進入細胞核，磷酸化的GLI2進入細胞核后與LncBCAR4結(jié)合一起將SNIP1/P300、PNUTS-Pp1結(jié)合到靶標基因的啟動子上,誘導啟動子組蛋白乙酰化，促進靶標基因表達。

（二）實驗流程：

（三）核心FIGURE：

Figure1說明的是CCL21誘導GLI2的磷酸化使其與LncBCAR4結(jié)合，促進LncBCAR4與SNIP1、PNUTS結(jié)合從而促進靶標基因的表達。

A、 RNA pull-down，用LncBCAR4探針從MDA-MB-231中釣取與之結(jié)合的蛋白，進行WB檢測，結(jié)果表明LncBCAR4結(jié)合蛋白GLI2、SNIP1和PNUTS。

B、 使用CCL21等處理細胞后用WB檢測GLI2的磷酸化情況，表明CCL21能促進GLI2的磷酸化。

C、 通過分別敲低CTL和CIT之后檢測經(jīng)CCL21處理的GLI2，結(jié)果表明CCL21不影響GLI2的表達而是影響其磷酸化水平。

D、  用CCL21處理不同時間后檢測細胞質(zhì)和細胞核的GLI2磷酸化情況。

Figure2說明的是LncBCAR4將SNIP1和PNUTS結(jié)合到靶標基因啟動子上促進組蛋白的乙酰化。

A、 CHIP，分別用GLI1和p-GLI2抗體釣取DNA片段，表明CCL21處理后靶標基因啟動子上結(jié)合的GLI2和p-GLI2上升。

B、 CHIRP，用LncBCAR4探針釣取與之結(jié)合的DNA片段進行qPCR檢測，結(jié)果表明經(jīng)CCL21處理后靶標基因啟動子上結(jié)合的LncBCAR4增加。

C、 RNA pull-down，用LncBCAR4探針釣取與RNA結(jié)合的蛋白，檢測SNIP1、PNUTS與LncBCAR4結(jié)合的區(qū)域，

D、  EMSA檢測LncRNA與SNIP1、PNUTS的結(jié)合。

E、 RIP，反向驗證SNIP1、PNUTS與LncBCAR4結(jié)合的區(qū)域。

F、 CHIP，靶基因啟動子乙酰化的組蛋白，表明CCL21處理后組蛋白乙酰化增加。

G、  用qRT-PCR檢測LncBCAR4敲低后的靶標基因的表達情況,結(jié)果表明BCAR4敲低后靶標基因的表達量下降。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)項目

本公司可進行類似實驗的實驗設(shè)計及整體實驗外包項目，包括RNA pull-down、WB、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達/敲低）、CHIP、RIP、q-pcr，其中RNA pull-down、CHIP、RIP為本公司主營項目。

一、RNA pull-down：是檢測RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間的相互作用，主要研究lncRNA與蛋白的相互作用。

用LncBCAR4探針釣取與RNA結(jié)合的蛋白，然后用目的蛋白抗體對產(chǎn)物進行WB檢測，表明LncRNA BCAR4與CIT、GL12、SNIP1以及PNUTS都能特異性的結(jié)合。我公司在實驗體系中同時提供lncRNA正義鏈與反義鏈的pull down。

二、CHIP技術(shù)：主要研究蛋白與基因啟動子之間的關(guān)系

    例一：

本實驗GLI2和磷酸化的GLI2抗體進行CHIP從不同細胞中獲取與蛋白結(jié)合的DNA片段，然后進行Q-PCR驗證，實驗結(jié)果表明經(jīng)CCL21處理后的細胞靶標基因啟動子上結(jié)合的GLI2和p-GLI2上升。

       例二：

本實驗用乙酰化的組蛋白抗體釣取與之結(jié)合的DNA片段，然后進行Q-PCR檢測目的基因啟動子，結(jié)果表明，經(jīng)CCL21處理后啟動子上的組蛋白乙酰化明顯增加。

三、RIP技術(shù)：主要研究蛋白與RNA的相互作用

本實驗為了驗證LncRNA與SNIP1結(jié)合位點，對LncRNA進行相應位點的突變后，用Myc標簽抗體釣取與帶標簽的SNIP1蛋白結(jié)合的RNA，然后進行QRT-PCR檢測CHIP產(chǎn)物中的RNA，實驗結(jié)果表明與SNIP1蛋白結(jié)合的LncRNA結(jié)合位點在97-274區(qū)間。

 參考文獻：Zhen Xing , Aifu Lin , Chunlai Li，et al. LncRNA Directs Cooperative Epigenetic Regulation Downstream of Chemokine Signals［J］. Cell. 2014, 159(5): 1110–1125.