RNA的m6A修飾在基因表達調(diào)控中的功能

日期：2020-03-05 標簽：m6A

圖1  m6A調(diào)控mRNA代謝的模式圖

m6A作為mRNA的普遍的修飾，在含有METTL3的甲基轉(zhuǎn)移酶時mRNA前體轉(zhuǎn)錄后立即發(fā)生m6A甲基化;而FTO和ALKBH5負責(zé)m6A去甲基化。 通過甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶之間的相互作用，m6A水平保持平衡，形成m6A結(jié)合蛋白的對接位點和RNA二級結(jié)構(gòu)的適當組裝。具有足夠的m6A水平的mRNA轉(zhuǎn)錄物可被適當剪接，轉(zhuǎn)運，翻譯或降解。而不平衡的m6A調(diào)節(jié)將在上述每一步引起RNA代謝的缺陷。

1、影響mRNA前體的剪接

mRNA前體的剪接是基因表達中的重要步驟，它涉及內(nèi)含子的精確切除和核中初級轉(zhuǎn)錄本外顯子的連接以產(chǎn)生成熟的mRNA。最早提出的m6A的作用之一是作為RNA剪接的調(diào)節(jié)劑，目前已有許多證據(jù)支持m6A與RNA剪接的相關(guān)性，盡管確切的機制尚不清楚。

例如，在經(jīng)環(huán)亮氨酸處理的禽肉瘤病毒感染的細胞中，存在mRNA前體的顯著累積，而成熟mRNA的減少；從METTL3敲低的HepG2細胞的m6A-IP/RNA-seq數(shù)據(jù)分析顯示，許多基因特別是甲基化基因顯示異構(gòu)體水平的差異表達，但是基因水平并無差異。同時，剪接的外顯子和內(nèi)含子顯著富集了m6A峰，表明m6A與mRNA的選擇性剪接之間的內(nèi)在聯(lián)系。

M6A對RNA剪接的作用可能是由于甲基化的發(fā)生會干擾剪接因子和mRNA之間的相互作用，m6A簇可能作為某些RNA結(jié)合蛋白的對接位點；或者，由于m6A使A-U堿基配的穩(wěn)定性降低，RNA二級結(jié)構(gòu)可能受到影響。另一個可能的機制是通過甲基轉(zhuǎn)移酶或脫甲基酶的相互作用，最近對ALKBH5的研究提出了m6A水平可能影響剪接因子的基因表達的另一種可能性。

圖2 m6A修飾對mRNA前體剪接的影響

2、調(diào)控RNA的核輸出

RNA剪接后，成熟的mRNA必須從細胞核中輸出以在細胞質(zhì)中翻譯或降解。研究者檢測到STH處理的HeLa細胞中細胞核mRNA的保留時間增加了40％，但是多聚腺苷酸化的RNA沒有變化。在具有增強的m6A水平的ALKBH5缺陷型細胞中，通過5-溴尿苷（BrU）摻入分析觀察到新生合成的RNA主要分布在細胞質(zhì)中。

據(jù)報道，不同的RNA種類通過核孔復(fù)合物利用不同的途徑進行核輸出。TAP-P15復(fù)合體是在銜接蛋白如ALY/REF銜接子、SR蛋白和TREX復(fù)合物的協(xié)助下用于mRNA輸出。由于ASF/SF2的磷酸化水平?jīng)Q定其在剪接或核輸出中的功能，因此推測由ALKBH5缺陷引起的ASF/SF2磷酸化減少將加強其與TAP/P15復(fù)合物的相互作用從而導(dǎo)致核mRNA輸出加速。與mRNA不同，rRNA可以招募幾種不同的途徑使其出口更有效率。rRNA核出口可能不會受到ALKBH5缺陷的顯著影響。有趣的是，ALKBH5缺陷也導(dǎo)致細胞質(zhì)中SRPK1蛋白異常聚集。 SRPK1負責(zé)剪接因子的磷酸化，以促進其參與前mRNA的剪接。

3、調(diào)控mRNA翻譯

大多數(shù)m6A修飾發(fā)生在外顯子，m6A在剪接后仍保留在成熟的mRNA中，因此，m6A也可以影響含m6A的mRNA的翻譯。小鼠DHFR mRNA體外甲基化后用兔網(wǎng)織紅細胞系進行體外翻譯，當比較甲基化轉(zhuǎn)錄物的翻譯水平和非甲基化轉(zhuǎn)錄物的翻譯水平時，檢測到甲基化的Mrna的翻譯1.5倍增加。當從環(huán)亮氨酸處理的細胞中純化的細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄物在體外翻譯時，由甲基化mRNA產(chǎn)生的DHFR蛋白的量比未處理的mRNA低20％。

近期的使用體外翻譯以及將報告基因mRNA轉(zhuǎn)染入細胞的研究顯示，與未甲基化的轉(zhuǎn)錄物相比，腺苷甲基化導(dǎo)致翻譯減少。因此，m6A對蛋白質(zhì)生產(chǎn)的影響似乎在不同的mRNA中是不一致的。一種可能性是這種效應(yīng)部分由轉(zhuǎn)錄本內(nèi)的其它順式作用因子決定，或者mRNA中m6A的位置可能影響其與特定的介導(dǎo)其對翻譯的作用的反式作用因子相互作用的能力。

圖3  m6A修飾對mRNA翻譯的影響

4、影響mRNA的穩(wěn)定性

 mRNA降解的調(diào)節(jié)是影響總體細胞mRNA豐度的主要因素。由于在poly（A）尾部中未檢測到m6A，因此它可能不涉及聚腺苷酸化依賴性的mRNA降解。 Camper SA等人已經(jīng)通過用STH處理HeLa細胞來檢查對mRNA穩(wěn)定性的影響發(fā)現(xiàn)，盡管在高達500μMSTH的存在下m6A抑制幾乎完全，但mRNA穩(wěn)定性沒有受到很大的影響。然而，如通過高通量測序分析所鑒定的，m6A富集在3’UTR區(qū)域中,3’UTR包含mRNA降解所需的幾個重要功能域，如富含AU的元件（ARE），鐵反應(yīng)元件（IRE）和細胞質(zhì)聚腺苷酸化元件（CPE）。同時，3’UTR是microRNA（miRNA）靶向的區(qū)域，因此不能排除m6A參與調(diào)控mRNA穩(wěn)定性的可能性。

舉例來說，潛在的m6A結(jié)合蛋白ELAV1 / HuR能夠結(jié)合ARE區(qū)并穩(wěn)定相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物。對照和METTL3敲低細胞中差異mRNA表達水平的分析表明m6A穩(wěn)定mRNA。甲基化的失去降低含有m6A4的轉(zhuǎn)錄本的表達水平。這種效應(yīng)對于在內(nèi)含子中含有m6A的mRNA是最突出的。這些數(shù)據(jù)的一個可能的解釋是m6A是正確剪接mRNA所需要的，當被破壞時導(dǎo)致剪接受損和隨后的mRNA降解。m6A對mRNA穩(wěn)定性的影響可能是基因特異性的，因此全局RNA穩(wěn)定性的顯著變化不太可能發(fā)生。

圖4  m6A對mRNA穩(wěn)定性的影響

5、與microRNA的關(guān)聯(lián)性

MeRIP-Seq數(shù)據(jù)集的分析揭示了m6A與miRNA結(jié)合位點之間的存在著很強的相關(guān)性。含有m6A峰的67％的3'UTR也含有至少一個TargetScan預(yù)測的miRNA結(jié)合位點。因為大約30％的基因在其3'UTR中具有miRNA結(jié)合位點，所以這是顯著增強的關(guān)聯(lián)。重要的是，m6A峰和microRNA位點不重疊。通常，m6A峰在終止密碼子附近是最豐富的，并且通常沿3'UTR長度頻率降低，而microRNA靶位點在3'UTR的5'和3'末端富集.m6A在3'UTR和miRNA結(jié)合位點的存在提示了mRNA甲基化和microRNA之間的相互作用。確定腺苷甲基化是否有助于microRNA誘導(dǎo)的mRNA沉默的作用將是重要的。

另外，目前已有相關(guān)證據(jù)證明了m6A影響microRNA前體的剪接加工：m6A在轉(zhuǎn)錄本上的存在會影響選擇性剪接，但是這種標記的核閱讀器能夠介導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄本的處理，但還沒有被確定。研究人員發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白HNRNPA2B1在體內(nèi)和體外結(jié)合帶有m6A的RNA， HNRNPA2B1直接結(jié)合一組核轉(zhuǎn)錄物并以與m6A“作者”METTL3類似的方式調(diào)節(jié)其選擇性剪接。此外，HNRNPA2B1與初級miRNA轉(zhuǎn)錄本子集中的m6A標記結(jié)合，與microRNA微處理器復(fù)合蛋白DGCR8相互作用，并促進pri-miRNA加工。

圖5  m6A對pri-microRNA剪接的影響

參考文獻：

1、Xu Zhao,Ying Yang,Bao-FaSun,et al.FTO-dependent demethylation of N6-methyladenosine regulates mRNAsplicing and is required for adipogenesis.Cell Research,2014,24:1403-1419

2、Kate D. Meyer,Samie R.Jaffrey. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expressioncontrol.Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(5):313–326

3、Hao Du,Ya Zhao,Jinqiu He,etal. YTHDF2 destabilizes m6A-containing RNA through

directrecruitment of the CCR4–NOT deadenylase complex.NAT COM,2016,7:12626

4、Yamei Niu,Xu Zhao,Yong-ShengWu,et al.N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: An Old Modification with A NovelEpigenetic Function.Genomics Proteomics Bioinformatics, 2013,8–17

5、Xiao Wang,Zhike Lu,AdrianGomez,et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNAstability.LETTER,2014,10.1038/nature12730

6、Claudio R. Alarcón,HyeseungLee,Hani Goodarzi,et al. N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing.Nature,2015,519(7544):482–485

7、Claudio R. Alarcón,Hani Goodarzi,HyeseungLee,et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m6A-dependent nuclear RNA processingevents. Cell,2015,162(6):1299–1