The LINK-A lncRNA activates normoxic HIF1α signalling in triple-negative breast cancer

日期：2017-08-16 標簽：The,LINK-A,lncRNA,activates,normoxic,HIF1α,signalling,in,triple-negative,breast,cancer

轉錄因子相關調控研究案例（二）

一、調控通路

LncRNA LINK-A在細胞質中與蛋白BRK、LRRK2結合，當有胞外因子刺激時，LINK-A與蛋白復合物接收EGFR/GPNMB信號然后與轉錄因子HIF1結合，BRK將HIF1的Tyr 565磷酸化，LRRK2將HIF1的Ser 797磷酸化，HIF1磷酸化后進入細胞核與P300共同作用于癌相關基因的啟動子促進基因轉錄表達。

二、實驗流程

作者首先通過檢測三陰乳腺癌細胞和正常細胞的LINK-A表達驗證在三陰乳腺癌中LINK-A高表達確定本文的主角；為了驗證LINK-A與蛋白BRK和LRRK2結合，作者分別進行RNA pull-down、RIP、dot-blot驗證并找出了與這兩種蛋白結合的RNA位點；EGFR/GPNMB信號通路的激活：作者分別用RNA pull-down、co-IP、純化標簽融合蛋白的co-IP等實驗驗證了胞外因子HB-EGF刺激信號通路使HIF1磷酸化；用FISH、RIP和胞外激酶實驗驗證HB-EGF刺激使細胞中EGFR/GPNMB與LINK-A、BRK/LRRK2互作；用體外激酶實驗和各種WB實驗檢測HIF1的磷酸化位點；作者先用co-IP驗證HIF1與P300的互作，再通過對LINK-A進行BRK、LRRK2結合位點的突變檢測HIF1的磷酸化和P300的結合來說明磷酸化的HIF1與P300互作是通過LINK-A與BRK、LRRK2結合后介導的；最后作者通過CHIP實驗驗證磷酸化的HIF1結合到靶標基因啟動子上促進基因的表達。

三、核心FIGURE：

     Figure1說明的是LINK-A與蛋白BRK和LRRK2結合，并找到的與蛋白結合的RNA位點。

A、RNA pull-down，用LncRNA Link-A探針釣取細胞內(nèi)與之結合的蛋白，聯(lián)用質譜分析。

B、RIP實驗，用BRK和LRRK2蛋白抗體釣取與蛋白結合的RNA，然后進行Q-PCR檢測驗證Link-A與這兩種蛋白高度結合。

C-D、RNA pull-down，用LINK-A探針分別與純化的帶FLAG標簽融合蛋白BRK和帶MYC標簽的融合蛋白LRRK2孵育釣取結合蛋白，然后進行WB檢測表明LINK-A直接與BRK以及LRRK2蛋白結合。

E、斑點印跡雜交，體外將生物素標記的LINK-A與標簽融合蛋白結合然后進行斑點雜交檢測LINK-A與蛋白的結合位點區(qū)段。

F、RNA pull-down，用LINK-A全長和去除斑點印跡法檢測到的與蛋白結合位點的突變探針釣取蛋白，然后進行WB驗證LINK-A與蛋白的結合區(qū)段。

   Figure2說明的是HB-EGF誘導LINK-A-蛋白復合體與信號通路蛋白EGFR/GPNMB結合，并促使HIF1磷酸化。

A、              RNA pull-down，細胞經(jīng)HB-EGF誘導后，用LINK-A探針釣取RNA結合蛋白，然后進行質譜檢測，表明HB-EGF刺激使LINK-A結合蛋白GPNMB、BRK、HIF1等。

B、WB，分別用EGFR和GPNMB抗體檢測經(jīng)生長因子處理后的細胞蛋白，結果表明HB-EGF處理后，EGFR與GPNMB結合。

C、Co-IP，用EGFR釣取經(jīng)各種胞外因子處理后細胞中與之結合的蛋白，然后進行WB檢測，表明經(jīng)HB-EGF處理后，EGFR與GPNMB結合。

D-E、分別用純化的帶標簽融合蛋白EGFR和GPNMB釣取經(jīng)HB-EGF處理后細胞中的結合蛋白，然后進行WB驗證表明EGFR與GPNMB直接結合。

F、Co-IP，分別用BRK、GPNMB和HIF1蛋白抗體釣取經(jīng)胞外因子處理后細胞中的結合蛋白，然后用HIF1磷酸化抗體進行WB檢測，結果表明HB-EGF誘導HIF1磷酸化。

G、體外激酶實驗，表明GPNMB被磷酸化。

H、用純化的GPNMB帶釣取經(jīng)HB-EGF處理后中與之結合的蛋白，然后進行WB檢測，表明HB-EGF處理后BRK與GPNMB結合并被磷酸化。

   Figure3說明的是HB-EGF誘導細胞EGFR/GPNMB與BRK、LRRK2互作。

A、FISH，分別對LINK-A敲低細胞經(jīng)HB-EGF處理后的細胞中EGFR和BRK進行定位，表明HB-EGF處理使這兩種代表有互作。

   B、LINK-A與蛋白BRF、LRRK2結合位點信息。

C、RIP，分別用LINK-A全長和去除蛋白結合位點的探針釣取細胞中與之結合的蛋白，然后用磷酸化的蛋白抗體進行WB驗證，表明GPNMB和BRK磷酸化并驗證了B圖所示的結合位點。

D、FISH，表明HB-EGF處理后的細胞中EGFR和磷酸化的BRK互作。

E-F、體外激酶實驗。

G、體外RNA-蛋白結合實驗，用完整蛋白和去除部分組分的蛋白與LINK-A全長和去除蛋白結合位點的RNA進行結合實驗。

      Figure4說明的是HB-EGF激活信號通路BRK促進HIF1 Tyr565位點磷酸化，HIF1 Tyr565的磷酸化使Pro564羥基化。

A、體外激酶實驗，表明HIF1的磷酸化位點為Tyr565和Ser797。

B、體外激酶實驗，BRK促進HIF1 Tyr565位點磷酸化。

C、WB檢測HB-EGF誘導各種蛋白磷酸化情況。

     D-F、LINK-A敲低后經(jīng)HB-EGF誘導的各種蛋白磷酸化情況。

G、HB-EGF處理細胞不同時間后檢測HIF1 Tyr565和Ser797位點的磷酸化Pro564羥基化。

H、LINK-A敲低后經(jīng)HB-EGF誘導的HIF1 Tyr565和Ser797位點的磷酸化Pro564羥基化。

I、各種蛋白敲低后經(jīng)HB-EGF誘導的HIF1 Tyr565和Ser797位點的磷酸化Pro564羥基化。

   Figure5說明的是LINK-A促進HIF1磷酸化，磷酸化的轉錄因子HIF1與P300互作促進靶標基因的轉錄。

A、co-IP，用HIF1抗體釣取LINK-A和LRRK2敲低后經(jīng)HB-EGF誘導細胞中的結合蛋白，然后用WB驗證，表明磷酸化的HIF1與P300結合。

B、co-IP，用純化的帶標簽融合HIF1和Ser797位點突變的HIF1與細胞總蛋白孵育，然后用標簽抗體釣取結合蛋白進行WB驗證，表明Ser797位點突變的HIF1不能與P300結合。

C、將LINK-A全長和BRK、LRRK2結合位點突變的表達載體導入細胞，然后檢測經(jīng)HB-EGF誘導后的磷酸化的HIF1，表明LINK-A的BRK、LRRK2結合位點突變后，HIF1不能磷酸化。

D-E、CHIP-seq，HIF1抗體釣取HB-EGF處理后的細胞中與之結合的DNA片段，然后進行高通量測序，C為HIF1結合的DNA富集motif，D為結合的靶標。

F、CHIP-q-pcr，HIF1抗體釣取HB-EGF處理后的細胞中與之結合的DNA片段然后進行Q-PCR驗證，表明HB-EGF促進HIF1與靶標基因啟動子結合。

本公司可提供的技術服務項目

本公司可進行類似實驗的實驗設計及整體實驗外包項目，包括RNA pull-down、RIP、WB、慢病毒穩(wěn)轉株的建立（過表達/敲低）、Q-PCR、FISH、CHIP，其中RNA pull-down、FISH、RIP、CHIP為本公司主營項目。

一、RNA pull-down：檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實驗手段之一。

本實驗作者用LINK-A探針釣取經(jīng)HB-EGF處理后的細胞裂解液中與之結合的蛋白，pull-down產(chǎn)物進行質譜檢測分析，篩選出HB-EGF誘導結合的蛋白。我公司在實驗體系中同時提供lncRNA正義鏈與反義鏈的pull down。

二、   RIP：主要--研究蛋白與RNA的相互作用

分別用BRK和LRRK2蛋白抗體釣取細胞中與蛋白結合的RNA，然后進行Q-PCR檢測，結果表明LINK-A與蛋白BRK和LRRK2結合。我公司在實驗體系中設置陽性及陰性對照，進一步排除系統(tǒng)誤差。

三、Co-IP：檢測蛋白與蛋白的互作。

 用EGFR蛋白抗體釣取經(jīng)不同胞外因子處理后細胞中與EGFR結合的蛋白，產(chǎn)物進行WB驗證，結果表明HB-EGF促進EGFR與GPNMB結合。

三、FISH：免疫熒光原位雜交，對細胞內(nèi)核酸和蛋白的定位。

作者用免疫熒光原位雜交對細胞內(nèi)的蛋白EGFR和BRK進行定位，結果表明經(jīng)HB-EGF處理后細胞內(nèi)EGFR與BRK互作。我公司在實驗體系中設置陰性和陽性對照。

四、CHIP：主要研究蛋白與基因啟動子之間的關系

用HIF1抗體釣取LINK-A敲低細胞經(jīng)HB-EGF處理后與HIF1結合的DNA片段，產(chǎn)物進行Q-PCR檢測，結果表明LINK-A敲低后HIF1結合靶標基因啟動子下降，說明LINK-A在轉錄因子結合基因啟動子的重要作用。

參考文獻：Aifu Lin1,Chunlai Li1, Zhen Xing,et al. The LINK-A lncRNA activates normoxic HIF1α signalling in triple-negative breast cancer［J］. NATURE CELL BIOLOGY,2016, 10.1038/ncb3295