轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)研究案例（四）

日期：2017-09-21 標(biāo)簽：Noncoding,RNA

Noncoding RNA Gas5 Is a Growth Arrest and StarvationAssociated Repressor of the Glucocorticoid Receptor

一、調(diào)控通路

Gas5是一種在細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或生長(zhǎng)因子導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯時(shí)高表達(dá)的非編碼RNA，通過(guò)抑制糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的幾個(gè)應(yīng)答基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Gas5作為糖皮質(zhì)激素響應(yīng)原件誘餌與響應(yīng)原件（GRE）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到糖皮質(zhì)激素受體（GR）的DNA結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)控基因的表達(dá)。

二、實(shí)驗(yàn)流程

作者首先通過(guò)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在Dex處理后非編碼RNA Gas5與GR結(jié)合增加，然后又通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Gas5通過(guò)與GR互作抑制下游靶標(biāo)基因的表達(dá)。作者另外通過(guò)RNA免疫熒光原位雜交的核質(zhì)分離來(lái)說(shuō)明細(xì)胞受Dex刺激后Gas5和GR從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核起作用，然后通過(guò)chip實(shí)驗(yàn)表明dex刺激使細(xì)胞GR結(jié)合到靶標(biāo)基因啟動(dòng)子降低抑制基因的表達(dá)。隨后作者分別對(duì)Gas5進(jìn)行過(guò)表達(dá)和敲低后用dex處理細(xì)胞，檢測(cè)與GR應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)，表明dex刺激Gas與GR互作抑制靶標(biāo)基因表達(dá)。作者最后通過(guò)Gas5不同片段以及預(yù)測(cè)的與GR結(jié)合位點(diǎn)突變的熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Gas5與GR的結(jié)合位點(diǎn)。

三、核心FIGURE

Figure1說(shuō)明的是Gas5與GR結(jié)合互作抑制其對(duì)響應(yīng)原件基因的轉(zhuǎn)錄激活活性。

A-B、RIP實(shí)驗(yàn)，用GR抗體釣取Dex處理和未處理細(xì)胞中與GR結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行q-pcr檢測(cè)，表明在Dex處理后，細(xì)胞的Gas5與GR結(jié)合增加。

C、熒光素酶實(shí)驗(yàn)，將Gas5表達(dá)質(zhì)粒、GR表達(dá)質(zhì)粒和連接GRE的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后檢測(cè)熒光素酶活性，表明Gas5抑制GR的轉(zhuǎn)錄活性但不抑制包含GAL4的嵌合體的轉(zhuǎn)錄活性。

Figure2說(shuō)明的是Gas5在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都存在，在Dex處理后Gas5轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核參與GR應(yīng)答。

A、 RNA FISH，用Gas5探針檢測(cè)細(xì)胞中的Gas5的定位，表明細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均含有Gas5，下圖使用RNase處理作為陰性對(duì)照。

B、 核質(zhì)分離，用Dex處理細(xì)胞后進(jìn)行核質(zhì)分離，然后分別檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的GR和Gas5，表明Dex處理使細(xì)胞質(zhì)中的Gas5和GR轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核。

Figure3說(shuō)明的是Gas5的過(guò)表達(dá)抑制GR與響應(yīng)原件基因互作抑制基因mRNA的表達(dá)。

A、 Gas5過(guò)量表達(dá)檢測(cè)。

B、 Gas5過(guò)量表達(dá)后檢測(cè)clAP2 Mrna的表達(dá)，表明Gas5過(guò)量表達(dá)后Dex的處理使clAP2 mRNA的表達(dá)降低。

C、 ChIP實(shí)驗(yàn)，用GR抗體釣取Dex處理和未處理的Gas5過(guò)量表達(dá)細(xì)胞中與GR結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行q-pcr檢測(cè)跑膠，表明Dex處理使GR結(jié)合到clAP2啟動(dòng)子上減少。

Figure4說(shuō)明的是Gas5抑制GR誘導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素應(yīng)答基因mRNA的表達(dá)。

A、 Gas5表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用Dex處理，然后檢測(cè)細(xì)胞GR誘導(dǎo)的基因mRNA的表達(dá)，表明Gas5表達(dá)使mRNA表達(dá)降低。

B、 ChIP實(shí)驗(yàn)，Gas5表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用Dex處理，然后用GR抗體釣取細(xì)胞中與GR/GRE結(jié)合的DNA片段，進(jìn)行q-pcr檢測(cè)，表明Gas5表達(dá)使GR/GRE與基因啟動(dòng)子結(jié)合降低。

                                  本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類似實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及整體實(shí)驗(yàn)外包項(xiàng)目，包括q-pcr、核質(zhì)分離、Luciferase assay、FISH、RIP、ChIP、WB、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過(guò)表達(dá)/敲低），其中核質(zhì)分離、Luciferase assay 、FISH、RIP、ChIP為本公司主營(yíng)項(xiàng)目。

一、Luciferase assay：熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系

將Gas5表達(dá)質(zhì)粒、GR表達(dá)質(zhì)粒和連接GRE基因的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并用Dex處理細(xì)胞，然后檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性，表明Gas5抑制GR促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的活性但不抑制包含GAL4的GR嵌合體的活性。

二、RNA-FISH：RNA的免疫熒光原位雜交技術(shù)，對(duì)細(xì)胞中RNA進(jìn)行定位的重要方法。

用Gas5的RNA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Gas5，綠色熒光為Gas5的位置，藍(lán)色為細(xì)胞核位置，作者用Rnase處理細(xì)胞作為陰性對(duì)照，表明Gas5存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陰陽(yáng)性內(nèi)參。

三、核質(zhì)分離：對(duì)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行分類后，檢測(cè)其中目的RNA或蛋白含量，是RNA和蛋白定位的重要手段之一。

用Dex處理細(xì)胞后進(jìn)行核質(zhì)分離，然后分別檢測(cè)其中的Gas5和GR，表明Dex處理使細(xì)胞質(zhì)中的Gas5和GR轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核。Α-tubulin是細(xì)胞質(zhì)的標(biāo)志物，Oct1是細(xì)胞核的標(biāo)志物。

四、RIP：RNA免疫共沉淀技術(shù)，是研究RNA與蛋白互作的重要手段。

用GR抗體釣取Dex處理和未處理細(xì)胞中與GR結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行q-pcr檢測(cè)，表明在Dex處理后，細(xì)胞的Gas5與GR結(jié)合增加。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陽(yáng)性及陰性對(duì)照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

五、ChIP：染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，主要研究轉(zhuǎn)錄因子與靶標(biāo)基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系

用GR抗體釣取Dex處理和未處理的Gas5過(guò)量表達(dá)細(xì)胞中與GR結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行q-pcr檢測(cè)跑膠，表明Dex處理使GR結(jié)合到clAP2啟動(dòng)子上減少。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陽(yáng)性及陰性對(duì)照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

參考文獻(xiàn)：Tomoshige Kino,Darrell E. Hurt,Takamasa Ichijo,et al. Noncoding RNA Gas5 Is a Growth Arrest and StarvationAssociated Repressor of the Glucocorticoid Receptor[J]. Sci Signal,2010, 3(107): ra8