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CRISPR-Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制
CRISPR Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生雙鏈DNA缺口后，生物體內(nèi)一般通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復(fù)（HDR）這兩種修復(fù)方式對斷裂的雙鏈DNA進(jìn)行修復(fù)。
◆ 修復(fù)方式一：非同源末端連接修復(fù)途徑（NHEJ）
NHEJ修復(fù)途徑是一種錯誤傾向修復(fù)機(jī)制，用于在缺少修復(fù)模板的情況下修復(fù)斷裂的雙鏈DNA。該途徑主要用于CRISPR Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因沉默。主要用于當(dāng)DNA發(fā)生斷裂時，NHEJ修復(fù)途徑被開啟，DNA斷裂處插入或缺失幾個堿基，然后雙鏈DNA的切割末端連接在一起，這個過程極容易導(dǎo)致切割位點(diǎn)發(fā)生移碼突變，從而沉默該基因（圖3）。因此，在沉默編碼基因時， gRNA應(yīng)靶向基因的N端來確保最大程度的基因破壞。
Figure 3 ：The non-homologous end joining repair mechanism attempts to ligate the ends of the DSB together without the use of a homologous template. This process is error prone as the loss or addition of a few nucleotides is inevitable with this mechanism. As a result NHEJ creates InDel mutations which either disrupt the reading frame of the gene or introduce premature stop codons.
◆ 修復(fù)方式二：同源性定向修復(fù)（HDR）
對比NHEJ修復(fù)途徑，同源性定向修復(fù)（HDR）途徑是更為精確的修復(fù)機(jī)制。 這種修復(fù)機(jī)制主要用于CRISPR Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲入。 在該修復(fù)路徑中，需要將一段與預(yù)期編輯位點(diǎn)上下游緊鄰序列具有高度同源性的DNA修復(fù)模板、特異的gRNA和Cas9核酸酶一起引入細(xì)胞中。 在高度同源性DNA模板存在的情況下， HDR機(jī)制可以通過同源重組將一段DNA插入編輯位點(diǎn)（圖4）。這種修復(fù)方式可以將一段DNA序列精準(zhǔn)地插入特定的基因組位點(diǎn)。
Figure 4 ： In the presence of a suitable repair template containing homology arms directly upstream and downstream of the double stranded break, the recombination-based homology directed repair mechanism is used. In this way precise changes—be it additions or deletion—can be made anywhere in the genome.
