廣州市黃埔區(qū)學(xué)大道攬月路廣州企業(yè)孵化器B座402
電話：020-85625352
手機：18102256923、18102253682
Email：[email protected]
Fax：020-85625352
QQ：386244141
CRISPR-Cas9-基因敲除系統(tǒng)（knock out）
實驗原理：
CRISPR-Cas9基因敲除系統(tǒng)是Cas9內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，生物體啟動NHEJ修復(fù)途徑，切割位點產(chǎn)生移碼突變，導(dǎo)致基因沉默。
NHEJ修復(fù)途徑是一種錯誤傾向修復(fù)機制，用于在缺少修復(fù)模板的情況下修復(fù)斷裂的雙鏈DNA。該途徑主要用于CRISPR Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因沉默。主要用于當(dāng)DNA發(fā)生斷裂時，NHEJ修復(fù)途徑被開啟，DNA斷裂處插入或缺失幾個堿基，然后雙鏈DNA的切割末端連接在一起，這個過程極容易導(dǎo)致切割位點發(fā)生移碼突變，從而沉默該基因（圖3）。因此，在沉默編碼基因時， gRNA應(yīng)靶向基因的N端來確保最大程度的基因破壞。
實驗流程：
1.設(shè)計sgRNA
2.構(gòu)建sgRNA-Cas9載體
3.構(gòu)建sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株
4 .篩細胞克隆并進行qPCR驗證
5 .陽性克隆測序，選擇敲除純合細胞株
6 .篩選細胞單克隆測序
實驗步驟：
? 1、設(shè)計sgRNA
針對小鼠LIF基因座（Mus musculus，NM_008501）設(shè)計了三種sgRNA。 進行軟件分析以確保sgRNA沒有預(yù)測的脫靶結(jié)合位點。
? 2、構(gòu)建sgRNA-Cas9載體
然后將選擇的sgRNA設(shè)計克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-One lentivector中（圖1）。
圖1 sgRNA-Cas9載體圖譜
? 3、構(gòu)建sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株
利用慢病毒包裝體系構(gòu)建sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株，進行嘌呤篩選
? 4、 篩細胞克隆并進行qPCR驗證
嘌呤霉素篩選后分離細胞克隆。 提取基因組DNA并進行驗證測定目的基因座是否進行編輯.
圖2 qPCR檢測基因組編輯情況。在野生型（WT）測定中的單個條帶表示沒有發(fā)生編輯; 兩個較小的條帶（總和WT的長度）表示編輯已經(jīng)發(fā)生。圖2表明，克隆 3和6編輯; 克隆2沒有編輯; 克隆1是不確定的。
?5 、陽性克隆測序，選擇突變細胞株
通過Sanger測序進一步分析細胞集落3和6的PCR產(chǎn)物以確定敲除的性質(zhì)（圖3）。
圖3 細胞基因組測序結(jié)果。對于細胞集落3，只檢測到一個突變序列，表明這些細胞可能只是雜合敲除。 在菌落6中檢測到兩種不同的突變序列。
? 6 、篩選細胞選擇單克隆純合突變細胞株
將菌落6連續(xù)稀釋到96孔板中進行單克隆選擇。 從這些克?。?/span>6a，6b ..）中提取基因組DNA，進行PCR擴增，克隆和測序。
圖4細胞基因組測序結(jié)果。測序顯示，在兩個等位基因中只有克隆6a具有移碼突變（圖4）。 移碼突變破壞了開放閱讀框架，導(dǎo)致無意義介導(dǎo)的mRNA。
? 7.進一步測序，確定純合突變
圖5 細胞基因組測序結(jié)果
