作者為了對GSCs與NSPCs細(xì)胞中染色質(zhì)開放性進行研究，利用CD24/34/45-PE抗體通過流式細(xì)胞術(shù)從神經(jīng)膠質(zhì)瘤（GBM）與神經(jīng)基質(zhì)（GM）中分離具有干性的GSCs與NSPCs細(xì)胞。細(xì)胞膜上是否具有EGF的受體蛋白可作為判斷細(xì)胞是否處于增殖期，因此利用EGF-APC抗體把GSCs分為E-GBM和E+GSC兩個子集、把NPSC分為E-NPC和E+NSPC兩個子集（圖1a），然后分別對四個子集進行ATAC-seq測序分析。比較E-GBM與（E+GSC和E+NSPC）的ATAC-seq數(shù)據(jù)，獲得了與干性細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的5020個差異峰（圖1b）。用基因注釋工具（GREAT）對差異峰進行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，GSC與NSPC共有基因的主要功能與維持細(xì)胞活性、細(xì)胞增殖相關(guān)（圖1c）。作者將分析重點放在GSC和NSPC之間的差異，發(fā)現(xiàn)了10509個差異峰（圖1d），并對差異峰進行基因注釋和功能分析發(fā)現(xiàn)，GSC與NSPC差異基因的主要功能與細(xì)胞遷移、運動、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相關(guān)（圖1e）。這表明GSCs主要以細(xì)胞遷移為主要特征。

   作者對四組的ATAC-seq數(shù)據(jù)進行motif分析，通過比較（E-GBM+NSPC）與E+GSC的ATAC-seq數(shù)據(jù)得出腫瘤特異性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子列表（圖2a）。比較E-GBM與（E+GSC和E+NSPC）的ATAC-seq數(shù)據(jù)得出干性細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子列表（圖2b）。對E+GSC/E-GBM細(xì)胞進行RNA-seq測序，檢測多種轉(zhuǎn)錄因子表達情況，發(fā)現(xiàn)TEAD1在GSC中具有較高的表達水平，且在E+GSC中表達更高（圖2c）。

為了評價TEAD1與GBM亞型的相關(guān)性，作者從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得了GBM中TEAD家族的RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了TEAD1表達最高（圖2d）。并且在作者分選細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)中也得到了相同的結(jié)果（圖2e）。

作者利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)在GBM中分別敲除TEAD1和TEAD4（圖3a）。比較在無血清培養(yǎng)基中對照組與兩個敲除組細(xì)胞的生長曲線，發(fā)現(xiàn)敲除TEAD1會導(dǎo)致生長抑制更加明顯（圖3b）。在低附著條件下比較三組細(xì)胞形成細(xì)胞球的數(shù)量（圖3c）和球體的直徑（圖3d），TEAD1敲除株中細(xì)胞球的直徑最小。Transwell侵襲實驗（圖3e）與細(xì)胞球體分散測定（圖3f）中敲除TEAD1或TEAD4都會導(dǎo)致GBM遷移率減少的結(jié)果。最后，在TEAD1敲除組中恢復(fù)表達TEAD1，并觀察細(xì)胞球體遷移（圖3g），結(jié)果表明恢復(fù)表達TEAD1后能部分挽救敲除后的遷移缺陷。上述結(jié)果表明TEAD1/4與GBM的遷移能力相關(guān)。

作者使用TEAD1敲除細(xì)胞與GBM細(xì)胞在小鼠體內(nèi)進行原位移植，來觀察TEAD1在體內(nèi)是否同樣具有影響GBM細(xì)胞侵襲能力。在原位移植腫瘤細(xì)胞后3.5個月進行組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)敲除TEAD1后導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞侵襲能力下降，處于增殖期的細(xì)胞數(shù)減少（圖4a），組織中TEAD1蛋白表達下降（圖4b），切片中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量下降（圖4c）。通過評價每張切面中腫瘤擴散的面積總和與腫瘤的體積（圖4d）發(fā)現(xiàn)敲除組細(xì)胞擴散范圍主要位于注射部位，而GBM組細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲范圍較遠（圖4e）。以上結(jié)果表明，TEAD1在體內(nèi)也會影響GBM的遷移能力。

根據(jù)RNA-seq與ATAC-seq數(shù)據(jù)分析基因表達與染色質(zhì)開放性的相關(guān)性（圖5a），結(jié)果顯示中高水平基因表達與基因啟動子中開放染色質(zhì)存在的強相關(guān)性。對不同亞型的GBM細(xì)胞進行ATAC-seq分析，尋找TEAD1的靶基因（圖5b），其中EGFR、AQP4和CDH4的染色質(zhì)開放區(qū)域與TEAD1的motif有較強的相關(guān)性。用ChIP-PCR驗證TEAD1與EGRF、AQP4、CDH4的結(jié)合情況（圖5c），結(jié)果發(fā)現(xiàn)TEAD1與三個基因的結(jié)合能力較強。同時在敲除TEAD1會導(dǎo)致AQP4和CHD4蛋白表達水平下降（圖5d）。以上數(shù)據(jù)表明TEAD1作為AQP4和CDH4的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控AQP4和CDH4的表達。

已知EGFR與GBM的增殖、遷移能力相關(guān)，同時TEAD1也是EGFR的轉(zhuǎn)錄因子，因此作者進一步關(guān)注TEAD1與EGFR的關(guān)系。作者觀察到在體內(nèi)敲除TEAD1導(dǎo)致EGFR的蛋白水平表達下降（圖6a），然后在體外GBM細(xì)胞中驗證TEAD1與EGFR的調(diào)控關(guān)系，發(fā)現(xiàn)敲除TEAD1會導(dǎo)致EGFR表達下降、恢復(fù)TEAD1后EGFR的表達也得到恢復(fù)（圖6b）。最后驗證了EGFR下游兩個通路的關(guān)鍵基因AKT和ERK的表達，發(fā)現(xiàn)敲除TEAD1會導(dǎo)致pERK下降（圖6c）。

為了進一步尋找TEAD1參與調(diào)控細(xì)胞遷移的靶基因，通過比較ATAC-seq富集基因以及敲除TEAD1后GBM的RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)32個基因的染色質(zhì)開放區(qū)域與TEAD1的motif有相關(guān)性。其中AQP4是三個下游靶基因中唯一一個直接受TEAD1調(diào)控的基因（圖7a）。在后續(xù)的細(xì)胞球分散實驗中，敲除了TEAD1而過表達AQP4能恢復(fù)因TEAD1缺失而引起下降的侵襲能力（圖7b）。最后RT-QPCR結(jié)果表明在敲除組細(xì)胞中恢復(fù)TEAD1的表達能恢復(fù)AQP4的表達。這些數(shù)據(jù)進一步證明AQP4在GBM遷移中發(fā)揮作用，同時還證明了TEAD1和下游AQP4表達之間的直接機制聯(lián)系。