作者首先分析了幾個數(shù)據(jù)集表明Bcl6在Tfh分化過程中直接驅(qū)動Tox2表達（補充數(shù)據(jù)）。為了弄清Tox2是否在Tfh細胞中選擇性表達，作者分析Tox2基因座的表觀遺傳學特征，發(fā)現(xiàn)它在Tfh細胞中被活性染色質(zhì)標記H3K4me3標記而沒有被抑制性色氨酸標記H3K27me3標記，而在體外和非Tfh細胞或其他T細胞譜系中則相反（圖1A）。小鼠的Tfh細胞進行ATAC-seq分析表明與原始CD4 + T細胞相比，Tfh中Tox2基因座染色質(zhì)可及性增加（圖1B）。為了確認Tox2在Tfh細胞中選擇性表達，對CD4 + CD44lo，non-Tfh，pre-Tfh和Tfh細胞進行了分類并通過qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)Tox2的mRNA水平在CXCR5hiBcl6-RFPhi Tfh細胞中高表達（圖1C），并且與Cxcr5，Bcl6和Pdcd1緊密相關（圖1C）。另外補充數(shù)據(jù)中qRT-PCR結果顯示IL-6和IL-21在明顯誘導Tox2表達，而IL-21阻斷可增強Tox2表達，在Stat3或者Bcl6缺乏時Tox2 mRNA表達都降低。說明IL-6和IL-21誘導Tox2表達同時依賴于Stat3和Bcl6。

（1）Tox2的表達促進Tfh分化（圖略）

已有研究顯示Tox2可以促進人NK細胞中Tbx21的表達，為了驗證Tox2在CD4 + T細胞中是否具有相似的功能，作者構建了Tox2過表達的CD4 + T細胞，然后在中性和Th1分化條件下對細胞進行分選和培養(yǎng)。顯示Tox2過表達使得Bcl6以及其他與Tfh相關的基因（包括Cxcr5，Il6st和Tcf7 ）mRNA及蛋白質(zhì)表達大量增加。然后，通過將Tox2轉(zhuǎn)導的細胞或其對照細胞轉(zhuǎn)移到受體小鼠中進行體內(nèi)通過CFA中的雞卵清蛋白（OVA）免疫進行免疫分析，表明Tox2轉(zhuǎn)導的細胞中的Tfh細胞的頻率顯著增加，而且相應的Tfh分化分子CXCR5，PD-1和Bcl6的表達增強。

（2）Tox2調(diào)節(jié)Tfh相關基因的轉(zhuǎn)錄

為了深入了解Tox2調(diào)節(jié)Tfh分化的機制，作者進行了RNA-seq分析。與Th0條件相比，在Tfh中2,913個基因的表達變化超過1.5倍，Tox2過表達細胞在Th0和Tfh條件下，分別有1,605和1,311個基因的表達改變了1.5倍以上（圖3A）。然后，作者選擇在Tfh細胞中差異表達的已發(fā)表基因進行基因集富集分析（GSEA）。首先評估了IL-6信號在Tfh發(fā)育過程中的作用，并觀察到Tox2-RV-GFP + CD4 + T細胞對Tfh細胞中促進的基因組顯著富集（圖3B），在Tfh細胞中受阻的基因在空對照細胞中更富集。通過不同的表達基因（DEG）和GSEA分析，Tox2促進了許多Tfh標志基因（Bcl6，Cxcr5，Pdcd1等）的表達，并抑制了許多在Tfh細胞中被抑制的基因（Gzmb，IL2ra等）的表達（圖3C）。同時，Th1相關基因（Il12rb2和Tbx21）和Th17相關基因（Il17a，Il17f，Ahr和Rorc）在Th0和Tfh樣條件下mRNA表達中也被Tox2抑制（圖3C）。

 為了確定Tox2是否直接調(diào)節(jié)上面的基因，作者通過ChIP-seq檢測了Tox2靶基因，確認了4,628個Tox2結合峰，其中分別有46％、24.6％和35.4％的內(nèi)含子、啟動子和遠端基因間區(qū)域富集（圖3D）。比較顯示，在2908個Tox2結合基因中，有336個受Tox2轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括Bcl6，Cxcr5，Tcf7和Il2ra（圖3E）。在Tfh標志基因（Bcl6，Cxcr5，Pdcd1和Batf）和炎性標志基因（Il2ra，Tbx21，Rorc，Il2和Il17a）中發(fā)現(xiàn)Tox2結合峰（圖3F）。為了確認結果，作者使用表達Tox2：HA的細胞對Bcl6和Cxcr5基因座進行了ChIP-qPCR分析證明了Tox2結合（圖3G）。此外，ATAC-seq發(fā)現(xiàn)Tox2結合位點與Tfh細胞中的可及區(qū)域相關（圖3F），從而驗證了Tox2在Tfh細胞中的功能。接下來，結合了三個數(shù)據(jù)集確定了共有59個直接受Tox2調(diào)控的基因，將這些基因與Bcl6靶標（74個基因）和Ascl2靶標（44個基因）進行比較發(fā)現(xiàn)Tox2、Bcl6和Ascl2僅共同激活了Slc9a9和Tcf7這兩個基因，其中TCF-1（ Tcf7）被證明是Tfh細胞生成的關鍵調(diào)控因子（圖3H）。Tox2和Bcl6可以抑制Th1相關的Ahr、Nek6、Socs2、Ncs1和Chd7基因表達，而Tox2和Ascl2可以抑制Th1相關的Tbx21、Il2ra和Ifitm3基因表達而Cxcr5表達上調(diào)（圖3H），表明在Tfh發(fā)育過程中Tox2與Bcl6和Ascl2協(xié)同作用。

 （3）Tox2功能促進染色質(zhì)重塑

由于Tox2包含與DNA結合并可能改變?nèi)旧|(zhì)構象的高遷移率族（HMG）盒，因此作者假設Tox2編程CD4 + T細胞中的染色質(zhì)重塑以促進Tfh細胞發(fā)育。通過ATAC-seq分析發(fā)現(xiàn)在Tfh與原始CD4 + T細胞之間存在超過26,000個區(qū)域的差異（圖4A）。在Th0條件下或在培養(yǎng)基中激活的被GFP病毒感染的T細胞，只有839個差異區(qū)。當Th0添加IL-6來形成類似Tfh的條件時，改變了2071個區(qū)域，其中Bcl6，Tcf7，Ror3和Il23r基因座更易獲得，而Il7r和Socs2基因座則更少。當Tox2過表達時，在Th0和Tfh條件下可分別8,700和13,000多個區(qū)域（圖4A）。因此，在Th0和Tfh條件下，阻斷IFNg，IL-4和IL-2會降低整體染色質(zhì)的可及性，而Tox2的表達會增加CD4 + T細胞中可及區(qū)域的數(shù)量。

數(shù)據(jù)顯示3,546個元素在染色質(zhì)可及性方面有所提高，包括Bcl6，Cxcr5和Pdcd1位點，在Tox2過表達后Tfh細胞中只有121個基因組位點關閉（圖4B和4C），在Th0和Tfh條件下培養(yǎng)的T細胞中，Bcl6，Cxcr5，Pdcd1和Tcf7區(qū)域也更容易接近（圖4D）。接下來，作者探索Tox2如何影響TF的活性，分析顯示，當在激活的T細胞中阻斷IFNg，IL-4和IL-2時，Stat1，Stat3，Stat4，Stat5和Stat6結合基序的富集減少（圖4E），IL-6信號傳導增加了AP-1家族和與Tfh或Th17相關的TF（例如Batf和Stat3）的活性（圖4E）。同時，在Th0和類似Tfh的條件下，Tox2過表達后結合力下降，其中Bach2，Prdm1和Stat5負調(diào)控Tfh分化（圖4E）。這些數(shù)據(jù)表明Tox2在Tfh分化過程中直接調(diào)節(jié)染色質(zhì)的可及性。

為了確定Tox2在Tfh分化中的重要性，作者通過CRISPR / Cas9在保守的外顯子3中刪除了14個堿基對，產(chǎn)生移碼突變和所有同工型的翻譯提前終止，證實Tox2缺陷型CD4 + T細胞的內(nèi)在缺陷會影響Tfh分化。同樣的發(fā)現(xiàn)Tox2缺陷型OT-II細胞顯示出Tfh分子CXCR5，PD-1，Bcl6，Ascl2，Bcl6，Cxcr5和Pdcd1的表達減少，但Il7r mRNA表達增加?？紤]到Tox家族除Tox2之外還具有Tox，Tox3和Tox4成員，它們在Tfh細胞分化中是否具有任何冗余功能？首先檢測了Tox，Tox3和Tox4的mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)Tox2缺陷OT-II中Tox和Tox3（幾乎沒有表達）表達有所增加但Tox4在這些細胞中的表達下降，這表明Tox在具有Tox2的Tfh細胞中可能具有功能冗余。此外，我們通過檢測Tfh細胞Tox  mRNA的表達證實了Tox在Tfh細胞中的高表達，這通過流式細胞術實驗得到了證實。

為了研究Tox在Tfh發(fā)育中的作用，在CD4 + T細胞中進行了Tox過表達，發(fā)現(xiàn)Tox在Th0和類似Tfh的培養(yǎng)條件下均能促進Bcl6，Ascl2，Cxcr5，Pdcd1，Il6ra，Il6st，Tcf7和Tox2 mRNA表達，表明Tox也可能促進Tfh的發(fā)育。然后，通過將Tox轉(zhuǎn)導的OT-II細胞轉(zhuǎn)移到Tcrbd /受體小鼠中，發(fā)現(xiàn)Tox的過表達在第7天顯著增加了Tfh細胞的百分比。同時，Tcrbd /小鼠中的GC B細胞也明顯增加。在mRNA水平上，Tox轉(zhuǎn)導的OT-II細胞具有更高的Ascl2，Bcl6，Cxcr5和Pdcd1表達。這些數(shù)據(jù)表明Tox2和Tox都參與促進Tfh發(fā)育。