Mapping the Global Chromatin Connectivity Network for SOX2 Function in Neural Stem Cell Maintenance

作者為了確定神經(jīng)干細胞中SOX2對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，  分析了不同品牌的RNA聚合酶Ⅱ（pol II）抗體在野生型小鼠NSC（wTR1、wTR2 、wTR3）和SOX2敲除小鼠NSC（mTR1、mTR2、mTR3）中所產(chǎn)生的ChIA-PET數(shù)據(jù)結果，鑒定了RNA pol II在啟動子結合位點和遠程互作位點（圖1b）。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在SOX2敲除組（mut）中，無論是啟動子結合位點還是遠程互作位點都比野生組（wt）少（圖1b）。同時，ChIA-PET結果顯示在敲除SOX2后，多個基因的啟動子的遠程互作減少（圖1C-G）。這些數(shù)據(jù)表明，SOX2主要通過調(diào)控基因啟動子的遠程互作來調(diào)控基因表達。

為了進一步確定SOX2對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，根據(jù)SOX2-ChIP-seq結果把結合位點分為TSS結合點與遠程結合點，并分別于H3K27ac+和H3K4me1+的ChIP-seq結果進行比較（圖2a，2b）。H3K27ac+是轉(zhuǎn)錄激活的標志蛋白，主要標示啟動子與增強子的位置。H3K4me1+也是轉(zhuǎn)錄激活標志蛋白，主要標示增強子位置。結果發(fā)現(xiàn)SOX2的結合位點主要在遠程增強子的位置。（圖2b）。然后作者把遠程互作模式分為三類：啟動子與遠程啟動子區(qū)域互作模式（P-P）、啟動子與遠程區(qū)域互作模式（P-e）、非啟動子間互作模式，比較發(fā)現(xiàn)pol II介導的遠程結合模式主要以p-p或p-e為主，約占90%（圖2c）。然后聯(lián)合SOX2-ChIP-seq結果發(fā)現(xiàn)SOX2的結合位點主要在p-e模式中（圖2d）。最后， SOX2的ChIP-seq數(shù)據(jù)，以及H3K27ac、H3K4me1的ChIP-seq，3種不同品牌的RNA聚合酶Ⅱ（pol II）抗體的ChIA-PET結果聯(lián)合分析，顯示SOX2的結合位點主要在遠程增強子區(qū)域。

在野生型小鼠NSC和SOX2敲除小鼠中，聯(lián)合pol II的ChIA-PET結果與SOX-2-ChIP-seq結果分析SOX2對下游靶基因的調(diào)控模式，結果顯示，SOX2在靶基因的遠程區(qū)域有許多結合位點，SOX2的敲除對靶基因的遠程互作有明顯的抑制作用。因此SOX2主要通過調(diào)控基因遠程結合區(qū)域來調(diào)控基因表達。

作者為了確定這些遠程結合位點是否具有增強子的作用，將SOX2遠程結合位點（即遠程增強子（DA））構建到熒光載體的啟動子前，并把這些熒光載體導入斑馬魚神經(jīng)干細胞中，驗證SOX2的結合位點是否是增強子（圖4）。結果SOX2遠程結合區(qū)域均能檢測到綠色熒光信號，這說明這樣遠程的結合位點具有增強子的作用。

對NSC細胞內(nèi)整體的RNA轉(zhuǎn)錄水平進行RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，敲除SOX2后，細胞整體RNA轉(zhuǎn)錄水平和具有遠程協(xié)作調(diào)控的相關RNA轉(zhuǎn)錄水平下降（圖5a）。當基因啟動子與越多的增強子有互作時，基因的表達量越高（圖5b）。接下來作者比較wt（野生型小鼠）與mut（SOX2敲除型小鼠）神經(jīng)干細胞之間的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在wt組中的表達比mut中的高（圖5c）。SOX2敲除，總體基因表達水平下降。然后對這些基因根據(jù)結合模式進行分組比較表達差異（圖5d），結果顯示差異表達基因主要是以P-E模式（啟動子與遠程增強子互作模式）互作。綜上所述，在NSC中，SOX2通過遠程互作模式對轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控。

SOCS3基因一種JAK/STAT信號傳導抑制因子，它能抵抗NSC早熟分化為星形膠質(zhì)細胞，同時也是SOX2的一個靶基因。RNA pol II的ChIA-PET結果與SOX2-ChIP-seq結果聯(lián)合分析顯示，SOX2在SOCS3基因的啟動子及遠程互作區(qū)域有集合位點，SOX2通過遠程互作調(diào)控SOCS3基因的表達（圖6a）。作者在SOX2敲除的神經(jīng)干細胞中過表達SOCS3，細胞的生長能力得到恢復（圖6b、6c）。

    綜上所述，SOX2主要通過介導染色質(zhì)遠程增強子與靶基因啟動子相互作用，對靶基因轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控。