Transcription Restart Establishes Chromatin Accessibility after DNA

 Replication

    DNA復(fù)制過程中，與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的 DNA結(jié)合蛋白會(huì)從DNA上游離，DNA進(jìn)行復(fù)制，復(fù)制完成后，轉(zhuǎn)錄因子又會(huì)重新結(jié)合到DNA上，回復(fù)轉(zhuǎn)錄水平，這個(gè)過程需要多長(zhǎng)時(shí)間，轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合順序是怎樣的，這是作者要討論的主題（圖1A）。作者為了區(qū)分復(fù)制與非復(fù)制細(xì)胞，利用5-乙炔基-20-脫氧尿苷（EdU）對(duì)DNA進(jìn)行標(biāo)記EdU為帶有標(biāo)記的dUTP，可以標(biāo)記新生成的DNA鏈）（圖1B）。通過EdU不同處理時(shí)間將細(xì)胞分為復(fù)制新生代細(xì)胞（EdU處理10分鐘）和復(fù)制后成熟細(xì)胞（EdU處理2小時(shí)）。并且通過流式將帶標(biāo)記的細(xì)胞分選出來（圖1C）。然后對(duì)新生代細(xì)胞、成熟期細(xì)胞、穩(wěn)態(tài)細(xì)胞的三個(gè)重復(fù)樣本進(jìn)行ATAC-seq分析，用聚類分析（圖1D）和主成分分析（圖1E），ATAC-peak（圖1F）分析比較組內(nèi)和組間差異。結(jié)果顯示成熟期與穩(wěn)定期比較相似，具有更多的開放區(qū)域。而子代細(xì)胞的染色質(zhì)開放區(qū)域較少。

    根據(jù)repli-ATAC-seq數(shù)據(jù)，比較子代細(xì)胞和成熟細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）（圖2A、B）、增強(qiáng)子位置（圖2C、D）附近的染色質(zhì)開放區(qū)域。結(jié)果顯示在成熟期細(xì)胞中，TSS區(qū)域和增強(qiáng)子位置有更強(qiáng)的repli-ATAC-seq富集信號(hào)，這表明在TSS區(qū)域和增強(qiáng)子位置中，成熟期比子代有更多的染色質(zhì)開放區(qū)域。對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行RNA聚合酶5號(hào)絲氨酸磷酸化（RNA polii S5phos）的CHIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（圖2E、F）,比較兩組的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示成熟期細(xì)胞具有更高的轉(zhuǎn)錄活性。綜合上述結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶難以與新生的染色質(zhì)結(jié)合，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默。

作者為了觀察染色質(zhì)開放區(qū)域在子代細(xì)胞不同生長(zhǎng)時(shí)間的變化（圖3A），比較子代細(xì)胞不同生長(zhǎng)時(shí)間后（0分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)）的repli-ATAC-seq數(shù)據(jù)，表明在30分鐘后染色質(zhì)開放區(qū)域開始開放（圖3B）。而RNA polii S5phos的ChIP-seq數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)錄程序在復(fù)制后30分鐘內(nèi)得到恢復(fù)，并在2小時(shí)后達(dá)到DNA復(fù)制前水平（圖3C）。隨著DNA復(fù)制后時(shí)間增加，全基因組（圖3D）和特定區(qū)域（圖3E）的TSS區(qū)域上富集信號(hào)逐漸增強(qiáng)。比較不同時(shí)間內(nèi)repli-ATAC-seq富集峰能達(dá)到正常水平時(shí)的數(shù)量（圖3F），結(jié)果表明在僅8%的染色質(zhì)開放區(qū)域來自于R0(新生代細(xì)胞)，隨著時(shí)間增加，越來越多的染色質(zhì)開放區(qū)域得到恢復(fù)（圖3G）。綜合上述結(jié)果顯示，染色質(zhì)開放程度在DNA復(fù)制后30分鐘開始恢復(fù)，并在2小時(shí)后恢復(fù)到復(fù)制前的水平。

比較不同時(shí)間的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域的repli-ATAC-seq富集峰變化（圖4A、B），發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子的開放性恢復(fù)模式（圖4A）與整體富集峰（圖3G）的分布模式相似。而只有2%的增強(qiáng)子在DNA復(fù)制完成時(shí)能達(dá)到最強(qiáng)的信號(hào)。因此作者對(duì)增強(qiáng)子的恢復(fù)模式進(jìn)一步研究，將增強(qiáng)子分為三類：1調(diào)節(jié)基本細(xì)胞過程的管家型增強(qiáng)子；2特異調(diào)節(jié)ESC細(xì)胞相關(guān)基因的ESC增強(qiáng)子；3作用于高度活躍的細(xì)胞特異性調(diào)控區(qū)域的強(qiáng)增強(qiáng)子。并比較三種增強(qiáng)子在不同時(shí)間的比例發(fā)現(xiàn)（圖4D、E），超級(jí)增強(qiáng)子在DNA復(fù)制后1小時(shí)內(nèi)90%得到恢復(fù)，這可能與整體的轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)。

染色質(zhì)的開放程度與基因的CpG含量有關(guān)，作者比較不同恢復(fù)類型的ATAC-SEQ中的CpG密度，發(fā)現(xiàn)R0峰的CpG密度最高，這可能與基因沉默相關(guān)（圖4F），同時(shí)R1峰和R2峰的在TSS區(qū)域的CpG密度比R0和R0.5的密度要高，這可能是隨著染色質(zhì)開放區(qū)域的增加，啟動(dòng)子附近的CpG島有更多的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合上去。

作者將repli-ATAC-seq富集峰分成三種模式：1立即恢復(fù)信號(hào)的立即峰；2緩慢恢復(fù)信號(hào)的緩慢峰；3瞬間恢復(fù)并在成熟期不表達(dá)的瞬時(shí)峰。結(jié)果顯示立即峰與緩慢峰主要出現(xiàn)在R0期，瞬時(shí)峰在早期就表現(xiàn)出來（圖5A）。而緩慢峰占總體比例為64%，瞬時(shí)峰占比例較少（圖5B）。將每個(gè)富集峰出現(xiàn)的位置進(jìn)行注釋，立即和緩慢峰的大部分是基因間的，可能代表遠(yuǎn)端順式調(diào)節(jié)元件。相反，大約75％的瞬時(shí)峰存在于基因體內(nèi)，或者在內(nèi)含子或外顯子中（圖5C）。立即和慢峰主要位于基因的5'末端，表明這些恢復(fù)類別中的大多數(shù)基因峰位于啟動(dòng)子區(qū)域，瞬時(shí)峰常見于3'末端（圖5D）。

作者選取那些在3'末端含有瞬時(shí)峰表達(dá)的基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些基因的長(zhǎng)度比平均值要長(zhǎng)（圖5E），并且相對(duì)表達(dá)量要高（圖5F），以及有更多的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)制標(biāo)記H3K36me3富集（圖5G）。對(duì)這些基因功能研究發(fā)現(xiàn)，這些基因與細(xì)胞周期、RNA轉(zhuǎn)錄加工途徑相關(guān)。這表明細(xì)胞基礎(chǔ)功能相關(guān)基因在早期就已經(jīng)完成轉(zhuǎn)錄。

六、轉(zhuǎn)錄是染色質(zhì)開放性修復(fù)的主要驅(qū)動(dòng)因素

作者用來抑制轉(zhuǎn)錄起始的抑制劑雷公藤內(nèi)酯和抑制轉(zhuǎn)錄延伸的DRB分別作用于子代細(xì)胞，研究轉(zhuǎn)錄對(duì)染色質(zhì)開放性的影響（圖6A）。對(duì)不同處理組的repli-ATAC-seq數(shù)據(jù)顯示，子代細(xì)胞的TSS區(qū)域和增強(qiáng)子區(qū)域都缺乏開放性（圖6B、C）。雷公藤內(nèi)酯處理后的成熟期細(xì)胞的染色質(zhì)開放性程度與子代細(xì)胞相似，表明轉(zhuǎn)錄起始可促進(jìn)染色質(zhì)的開放。主成分分析結(jié)果顯示子代細(xì)胞與成熟期細(xì)胞形成兩個(gè)不同的簇，雷公藤內(nèi)酯處理的成熟期細(xì)胞也單獨(dú)地形成一個(gè)簇（圖6D）。這些數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)錄是染色質(zhì)開放性修復(fù)的主要驅(qū)動(dòng)因素。

根據(jù)repli-ATAC-seq信號(hào)峰形成過程，把不同處理組按照立即峰、緩慢峰、瞬時(shí)峰分類（圖6E）。結(jié)果顯示雷公藤內(nèi)酯處理的成熟期細(xì)胞的瞬時(shí)峰富集程度最高；在緩慢峰中所有子代細(xì)胞都不能恢復(fù)到成熟期細(xì)胞的富集程度；而在立即峰中，兩種抑制劑都成熟期細(xì)胞影響較少。

這些分析表明，為了恢復(fù)染色質(zhì)穩(wěn)態(tài)可及性，大多數(shù)基因組區(qū)域都需要轉(zhuǎn)錄起始和延伸。

總結(jié)

作者分析repli-ATAC-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)新生的染色質(zhì)缺乏可接近的位點(diǎn)和RNA聚合酶II。在子傳代的2小時(shí)內(nèi)，RNA聚合酶占據(jù)和染色質(zhì)開放狀態(tài)重新建立。綜上所述，轉(zhuǎn)錄起始和延伸恢復(fù)了穩(wěn)態(tài)染色質(zhì)開放性區(qū)域。