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Luciferase 熒光素酶實(shí)驗(yàn)
啟動(dòng)子熒光素酶活性檢測(cè)
螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase Assay）是檢測(cè)這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合的重要手段，其原理簡(jiǎn)述如下：（1）用靶啟動(dòng)子的特定片段替換報(bào)告基因質(zhì)粒（如pGL3-basic）的啟動(dòng)子區(qū)。（2） 將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)。如果該轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則螢光素酶就會(huì)表達(dá)，且其表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。（3） 加入特定的底物，螢光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生螢光素，檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以對(duì)螢光素酶的活性定量，進(jìn)而判斷該轉(zhuǎn)錄因子能否與靶啟動(dòng)子片段發(fā)生作用 （及其作用強(qiáng)度）。
Promoter活性Luciferase實(shí)驗(yàn)常用載體——pGL3
3’-UTR活性檢測(cè)
由于miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至載體中報(bào)告基因luciferase的后面， 通過比較過表達(dá)或者干擾miRNA后，報(bào)告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測(cè)螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對(duì)目的基因的抑制作用；結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。
miRNA靶基因Luciferase實(shí)驗(yàn)常用載體——psiCHECK2
PCR擴(kuò)增Luciferase點(diǎn)突變靶基因
在熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)過程中我們?cè)O(shè)置一系列的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)以確保每一步實(shí)驗(yàn)的真實(shí)有效，如目的基因啟動(dòng)子片段擴(kuò)增跑膠圖、重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證跑膠圖、測(cè)序，最后結(jié)果分析。具體示例如下圖所示（以啟動(dòng)子熒光素酶為例）：
目的基因啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增
重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，證明目的基因片段插入到報(bào)告質(zhì)粒載體上。
啟動(dòng)子熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果示例，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子的關(guān)系，從上圖結(jié)果我們可以看出轉(zhuǎn)錄因子對(duì)目的基因的啟動(dòng)子起作用促進(jìn)基因的表達(dá)，而目的基因啟動(dòng)子片段突變后基因的表達(dá)就不受轉(zhuǎn)錄因子的影響。